微生物的遗传变异和育种.ppt

第八章 微生物的遗传变异和育种,遗传(heredity或inheritance)和变异(variation)是生物体最本质的属性之一。 1、遗传型（genotype）：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部遗传因子的总和。它是一种内在的可能性或潜力，其实质是遗传物质上所负载的特定遗传信息。 代谢 遗传型+环境条件 表型 发育,2、表型（phenotype）：指某一生物体所具有的一切外表特征及内在特征的总和，是遗传型在合适环境下的具体体现，是一种现实性。 3、 变异（variation）：指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变，即遗传型的改变。其特点是出现频率低(一般为10-510-10) 、可稳定遗传。 4、饰变（modification）：指不涉及遗传物质的改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。其特点是在整个群体中普遍出现相同的变化，不能稳定遗传。,第一节 遗传变异的物质基础,在生物体中，是否存在着专门行使遗传变异功能的物质这个问题，曾是生物学界长期争论不 休的重大基本理论问题之一。直至连续利用微生物这一有利的实验对象进行了3个著名的实验，才以确凿的事实证实了核酸尤其是DNA才是遗传变异的真正物质基础。 一、三个经典实验 经典转化实验 噬菌体感染实验 植物病毒的重建实验,（一）、经典转化实验 （1）动物试验（见图） （2）细菌培养试验 肺炎链球菌 （3）S型菌的无细胞抽提液的试验 活R菌+S菌的无细胞抽提液 长出大量R菌和少量S菌,热死S菌 不生长 活R菌 长出R菌 热死S菌+活R菌 长出大量R菌+10-6 S菌,这说明加热杀死的S型菌内，在其细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞，并使R型细胞获得表达S型的稳定的遗传性状。 1944年，美国科学家Avery等人又对实验进行了修改：,（二）、噬菌体感染实验 1952年，A.D.Hershey和M.Chase发表了证明DNA是噬菌体的遗传物质基础的著名实验。 首先，他们将E.coli 培养在以放射性32PO43-或35SO42-作为磷源或硫源的组合培养基中。结果，可以获得含32P-DNA的噬菌体或含35S-蛋白质的两种实验用噬菌体。 接着他们做了以下两组实验： 从以上两组实验中可清楚地看到，在噬菌体的感染过程中，其蛋白质外壳未进入宿主细胞 。进 入宿主细胞的DNA经增殖、装配后，能产生一大群既有DNA核心又有蛋白质外壳的完整噬菌体颗粒。这就有力地证明，在其DNA中，含有包括合成蛋白质外壳在内的整套遗传信息。通过电 子显微镜的观察也证实了这个论点。,（三）、植物病毒的重建实验 为了证明核酸是遗传物质，H.Fraenkel-Conrat用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。将TMV放在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将它的蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的RNA在没有蛋白质外壳包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中分离出正常病毒离子。当然，由于RNA是裸露的，所以感染频率低。在实验中，还选用了另一株与TMV近缘的霍氏车前花叶病毒（HRV）。整个实验的过程和结果见图。,当用TMV的RNA与HRV的蛋白质外壳重建后的杂合病毒去感染烟草时，烟叶上出现的是典型的TMV病斑。再从中分离出来的新病毒也是未带有任何HRV痕迹的典型TMV病毒。反之，用HRV的RNA与TMV的蛋白质外壳进行重建时，也可获得同样的结论。这充分说明，在RNA病毒中，遗传的物质基础也是核酸,三个经典实验充分证明了，只有核酸是负荷遗传信息的真正物质基础。 二、遗传物质在微生物细胞内的存在部位和方式 （一）七个水平 1.细胞水平 不论是真核微生物还是原核微生物，它们的大部或几乎全部DNA都集中在细胞核或核质体中。不同的微生物细胞或同种微生物的不同类型细胞中，细胞核的数目是不同的。例如，Saccharomyces cerevisiae(酿酒酵母)、Aspergillus niger(黑曲霉)、和Penicillium chrysogenum(产黄青霉)等真菌一般是单核的；有的如Neurospora crassa(粗糙脉孢菌)和A.oryzae(米曲霉)是多核的；藻状菌类真菌和放线菌类的菌丝细胞是多核的，而孢子则是单核的；在细菌中，杆菌细胞内大多存在两个核质体，而球菌一般只有一个。,2、细胞核水平 （1）真核生物的细胞核外被核膜，核内的DNA与组蛋白结合在一起，形成结构稳定的染色体； 原核生物的类核无核膜，呈松散的核质体状态存在，DNA也不与任何蛋白质结合。 （2）核外遗传物质：核外染色体 A) 真核生物的“质粒” ：细胞质基因（线粒体、叶绿体）；共生生物；酵母菌的2um质粒 B) 原核生物的质粒：F因子、R因子、Col质粒、Ti质粒、巨大质粒、降解性质粒,3.染色体水平 （1）染色体数： 在不同生物体的每个细胞核内，往往有不同数目的染色体。真核微生物常有较多的染色体，如Saccharomyces(酵母属)为17，Hansenula(汉逊酵母属)为4，Neurospora(脉孢菌属)为7等；而在原核生物中，每一个核质体只是由一个裸露的、光学显微镜下无法看到的环状染色体所组成。对原核生物来说，染色体水平实际上就是核酸水平。 （2）染色体倍数：除染色体的数目外，染色体的套数也不同。如果在一个细胞中只有一套相同功能的染色体，它就是一个单倍体。在自然界中发现的微生物，多数都是单倍体的；包含有两套相同功能 染色体的细胞，就称为双倍体。,只有少数微生物如一般的Saccharomyces cerevisiae(酿酒酵母)的营养细胞以及由两个单倍体的性细胞通过接合或体细胞融合而形成的合子，才是双倍体。在原核生物中，通过转化、转导或接合等过程而获得外源染色体片段时，只能形成一种不稳定的称作部分双倍体的细胞。 4.核酸水平 （1） 从核酸的种类来看，绝大多数生物的遗传物质是DNA，只有部分病毒(其中多数是植物病毒，还有少数是噬菌体)的遗传物质才是RNA。在真核生物中，DNA总是缠绕着组蛋白，两者一起 构成了复合物染色体；而原核生物的DNA都是单独存在的。,（2）在核酸的结构上，绝大多数 微生物的DNA是双链的，只有少数病毒为单链结构，例如E.coli的174和fd噬菌体 等；RN A也有双链(大多数真菌病毒)与单链(大多数RNA噬菌体)之分。 （3）从DNA的长度来看，真核生物的DNA比原核生物的长得多，但不同生物间的差别很大。如酿酒酵母的DNA长约6.5mm，E.coli约1.11.4mm，枯草芽孢杆菌约1.7mm，Haemophilus influenzae(嗜血流感杆菌)约 0.832mm。此外，同是双链DNA，其存在状态也不同：在原核生物中都呈环状；在病毒粒子中呈环状或线状；在细菌质粒中，DNA是呈超螺旋(或“麻花”)状。,5.基因水平 在生物体中，一切具有自主复制能力的最小遗传功能单位，都可称为基因。基因的物质基础是一个具有特定核苷酸顺序的核酸片段。每一个基因的分子量约为6.7105Da，约含1000-1500bp( 碱基对)，每个细菌一般含有5，00010，000个基因。 原核生物的基因调控系统是由一个操纵子(operon)和它的调节基因(regulator g ene)组成的。一个操纵子又包含3种基因，即结构基因(structure gene)、操纵基因(opera tor)和启动基因(promotor)。结构基因是通过转录和翻译过程来执行多肽(酶及结构蛋白)合 成的，操纵基因是与结构基因紧密连锁在一起的，是阻遏蛋白的附着部位，它能控制结构基 因转录的开放或关闭。,启动基因是转录的起始部位，是RNA多聚酶附着和启动的部位。操纵基因和启动基因不能转录RNA，不产生任何基因产物。调节基因一般与操纵子有一定间隔距离(一般小于100个碱基)，它是调节操纵子中结构基因活动的基因。 基因及表达产物（蛋白质）的名称规范书写方式。 6.密码子水平 遗传密码就是指DNA链上决定具体氨基酸的特定核苷酸的排列顺序。每个密码子(codon)是由3个核苷酸顺序所决定的，它是负载遗传信息的基本单位。各种生物都遵循着一套共同的密码。由于DNA上的三联密码子要通过转录成mRNA密码后才能与氨基酸相对应，因此，三联密码子一般都用 mRNA上的3个核苷酸顺序来表示。,7.核苷酸水平 上面讲的基因水平，实际上是一个遗传的功能单位，密码子水平是一个信息单位，而核苷酸水 平(即碱基水平)则可认为是一个最低突变单位或交换单位。在绝大多数生物的DNA组分中，都只含腺苷酸(AMP)、胸苷酸(TMP)、鸟苷酸(GMP)和胞苷酸(CMP)4种脱氧核苷酸，但也有少数例 外，它们含有一些稀有碱基。例如E.coli的T偶数噬菌体的DNA上就含有少量的5-羟甲基胞嘧啶。,（二）原核生物的质粒 1、质粒：质粒指游离于原核生物染色体外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状DNA分子，即cccDNA(circular covalently closed DNA)。1984年以后，在天蓝色链霉菌等放线菌中又发现携 带有抗生素合成基因的线形质粒。质粒上携带着某些染色体上所没有的基因，使细菌等原核生物被赋予了某些对其生存并非必不可少的特殊功能。例如接合、产毒、抗药、固氮、产特殊酶或降解有毒物质等功能。所以质粒的消失不会造成菌体死亡。,2、类型：质粒是一种复制子(replicon)。如果其复制与核染色体的复制同步，称为严紧型复制控制(st ringent replication control)。在这类细胞中，一般只含12个质粒;另一类质粒的复制与 核染色体的复制不同步，称为松弛型复制控制(relaxed replication control)，在这类细胞 中，一般含1015个或更多质粒。 整合：是指质粒（或温和噬菌体、病毒、转化因子）等小型非染色体DNA插入核基因组等大型DNA分子中的现象。 3、代表性质粒 （1）F因子（fertility factor） 又称致育因子，是大肠杆菌等细菌中决定“性别”的质粒。可通过接合转移。 （2）R因子（resistance factor） 又称抗药性质粒，具有多种抗生素抗性基因，并且可以在不同细菌中传递。可作为基因工程的载体。,（3）Col因子（colicinogenic factor） 即产大肠杆菌素因子，属严谨型质粒，也可通过接合转移。大肠杆菌素是有Col因子编码的细菌毒素，具有通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一杀死其它细菌的功能。 （4）Ti质粒（tumor inducing plasmid） 即诱癌质粒，存在于根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）之中，可引起多种双子叶植物的根癌。Ti质粒是当今植物基因工程研究中的重要载体。 （5）Ri质粒（root inducing plasmid）外源基因的载体，用于次生代谢产物的生产。 （6） mega质粒（巨大质粒） 在根瘤菌属（Rhizobium）中发现的一种质粒，分子量比一般质粒大几十到几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。 （7）降解性质粒 只在假单孢菌属（pseudomonas）存在的一系列质粒的总称，它们可以为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而可以分解利用一般细菌所难以分解的物质。这些质粒以其所分解的底物命名，如：CAM（樟脑）质粒、XYL（二甲苯）质粒、NAP（萘）质粒等。在环境保护上具有重大的应用价值。,第二节 基因突变和诱变育种,一、基因突变 基因突变（gene mutation）：简称突变，是变异的一种，指生物体内遗传物质的分子结构突然发生的可稳定遗传的变化。 （一）突变类型 （1）营养缺陷型（auxotroph）某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子的能力，因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型。它们可在加有特定生长因子的培养基上选出。 （2）抗性突变型（resistant mutant）由于基因突变而使原始菌株产生了对某种化学药物或致死物理因子抗性的变异类型。它们可在加有相应因子的培养基上选出。,（3）条件致死突变型（conditional lethal mutant）某菌株或病毒经基因突变后，在某种条件下可以正常的生长繁殖并实现其表型，而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型。例如：E.coil的Ts突变株（temperature-sensitive mutant，温度敏感突变型），可在37下正常生长，而不能在42下生长。 （4）形态突变型（morphological mutant）指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异。如：孢子的颜色、有无；鞭毛、荚膜的有无；菌落的表面情况等。 （5）抗原突变型（antigenic mutant）指由于基因突变而引起的抗原结构发生突变的变异类型。如：细胞壁缺陷型、鞭毛突变型等。 （6）产量突变型（producing mutant）通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌株有差别的突变株，分为“正变株”（plus-mutant）和“负变株”（minus-mutant）两种。,（二）突变率（mutation rate） 突变率：某一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率，也可以用某一单位群体在每一世代中产生的突变株的数目来表示。例如，突变率为110-8，就意味着108个细胞群体分裂成2108个细胞时，平均会形成一个突变体。 （三）基因突变的特点 1、不对应性： 即突变的性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。 （详后） 2、自发性：各种突变可以在没有人为因素的处理下自发发生； 3、稀有性：自发突变的频率是极低和稳定的，一般在10-610-9之间； 4、独立性：突变的发生一般是独立的，即在某一群体中，既可发生抗青霉素的突变型，也可发生抗链霉素或任何其他药物的抗药性。某一基因的突变，即不提高也不降低其他任何基因的突变率。突变不仅对某一细胞是随机的，且对某一基因也是随机的。,5、诱变性：通过诱变剂的作用，可以提高自发突变的几率10105倍； 6、稳定性：突变性状是稳定的、可遗传的； 7、可逆性：由原始的野生型基因变异为突变型基因的过程称为正向突变(forw ard mutation)，相反的过程则称为回复突变或回变(back mutation或reverse mutation)。实验证明，任何性状既有正向突变，也可发生回复突变。 （四） 基因突变的自发性和不对应性的证明 一种观点认为，突变是通 过适应而产生的，各种抗性就是由其环境所含的抵抗因子诱发出来的，即突变的原因和突变的 性状间是相对应的，并认为这就是“定向变异”，也有人称它为“驯化”或“驯养”。另一种 看法则认为，基因突变是自发的，且与环境不相对应。由于其中有自发突变、诱发突变、诱变剂与选择条件等多种因素错综在一起，所以难以探究问题的实质。从1943年起，通过几个严密的科学实验证明了自发突变的存在。,（五）基因突变的机制 、诱变机制 （1）碱基的置换（substitution） 类型：转换（transition）：即DNA链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换； 颠换(transversion)：即DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或是一个嘧啶被另一个嘌呤所置换。,置换的机制 ：直接引起置换的诱变剂：可直接与核酸反应，不论在机体内还是在离体条件下均有作用。如：亚硝酸、羟胺等。间接引起置换的诱变剂：此类诱变剂均为碱基类似物，如：5-BU，2-AP、5-AU等。 （2）移码突变（frame-shift mutation 或phase-shift mutation） 移码突变：指诱变剂使DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失，从而是该部位后面的全部遗传密码发生转录和转义错误的异类突变。点突变 移码突变诱变剂有：吖啶类染料（吖啶橙吖啶黄、原黄素等）和一系列ICR类的化合物。 ICR：由美国的癌症研究所（Institute for Cancer Research）合成，是一些由烷化剂与吖啶类化合物相结合的化合物。,（3）染色体畸变（chromosomal aberration） 某些理化因子，如X射线等的辐射及烷化剂、亚硝酸等，除了能引起点突变外，还会引起DNA的 大损伤(macrolesion)染色体畸变，它既包括染色体结构上的缺失(deletion)、重复(dup lication)、插入(insertion)、易位(translocation)和倒位(inversion)，也包括染色体数 目的变化。 种类：染色体内畸变；染色体间畸变 转座因子 ：插入序列（IS，insertion sequence）：只能引起转座效应而不含其它任何基因；转座子（Tn，transposon）除了与转座有关的基因外，常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因； Mu噬菌体（mutator phage即诱变噬菌体）是E.coil的一种温和噬菌体，无特定整合位点。,、自发突变的机制 （1）自发突变：没有人工参与下的生物体自然发生的突变。 （2）可能的机制： 1）背景辐射和环境因素的诱变； 2）微生物本身有害代谢物的诱变效应； 3）DNA复制过程中碱基配对错误引起。 （六）紫外线DNA的损伤及其修复 1、损伤机制：主要作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的嘧啶二聚体。二聚体的出现会减弱双链氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。,2、修复机制： 光复活作用（photoreactivation）：经紫外线照射过的微生物立即暴露于可见光下时， 可明显降低其死亡率的现象。光解酶的作用。 对照：8106个/ml E.coil 紫外线 100个/ml E.coil 试验：8106个/ml E.Coil紫外线 360490nm可见光30分钟 2106个/ml E.coil 暗修复（dark repair），又称切除修复（excision repair）：这种修复与光无关，必须有四种酶的参与：核酸内切酶 核酸外切酶 DNA聚合酶 连接酶。,二、突变与育种 （一）自发突变与育种 1、从生产中选育：在日常生产过程中，微生物也会以一定频率发生自发突变。富于实际经验和善于细致观察的人们就可及时抓住这类良机来选育优良的生产菌株。例如，从污染噬菌体的发酵液中有可能分离到抗噬菌体的新菌株。 2、定向培育优良品种：定向培育是指用某一特定因素长期处理某微生物的群体，同时不断的对它们进行移种传代，以达到积累并选择相应的自发突变株的目的。由于自发突变 的 频率较低，变异程度较轻微，所以培育新种的过程十分缓慢。与诱变育种、杂交育种和基因 工程技术相比，定向培育法带有“守株待兔”的性质，除某些抗性突变外，一般要相当长的时间。,（二）诱变育种 1、诱变育种：是指利用物理或化学诱变诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率显著提高，然后采用简便、快速、和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合育种目的的突变株，以供生产或科研之用。 2、诱变育种的基本环节（以产量突变为例）,3、诱变育种的几个工作原则 选择简便有效的诱变剂：诱变剂主要有两大类，即物理诱变剂和化学诱变剂。物理诱变剂如紫外线、X射线、射线和快中子等；化学诱变剂种类极多，主要有烷化剂、碱基类似物和吖啶类化合物。一切 生物的遗传物质都是核酸，尤其是DNA，一切诱变剂的作用机制都是引起DNA分子结构的改变。因此，凡对微生物有效的诱变剂，对高等生物同样有效，反之亦然。艾姆斯试验（Ames test）：是70年代中期所发明的利用微生物营养缺陷型的回变来检出化学致癌剂的一种方法。其基本原理是：鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸缺陷型（his-）菌株在基本培养基-的平板上不能生长，如发生回复突变则能生长。,挑选优良的出发菌株 ： 最好是经过生产中选育过的自发变异菌株； 采用具有有利性状的菌株； 选择已经发生其它变异的菌株作为出发菌株；在细菌中曾发现一类称为增变菌株的变异菌株，它们对诱变剂的敏感性比原始菌株大为提高，故更适宜作出发菌株。,处理单孢子（或单细胞）悬液： 处理均匀； 避免长出不纯的菌落 表型延迟现象：表型的改变落后于遗传型改变的现象。 选用最适剂量：诱变剂的作用：提高突变的频率；扩大产量变异的幅度；使产量变异向正变 (即提高产量的变异)或负变(即降低产量的变异)的方向移动。例如U.V.诱变时，采用杀菌率为7075%的相对剂量。 充分利用符合处理的协同效应：诱变剂的复合处理常呈现一定的协同效应。复合处理有几类：一类是两种或多种诱变剂的先后使用；第二类是同一种诱变剂的重复使用；第三类是两种或多种诱变剂的同时使用。 利用和创造形态、生理与产量间的相关指标,设计采用高效筛选方案 筛选工作分为初筛和复筛两步。初筛以量为主（选留较多有生产潜力的菌株），复筛以质为主（对少量潜力大的菌株代谢产物量作精确测定）。,（8）创造新型筛选方法,4、营养缺陷型菌株的筛选 与筛选营养缺陷型有关的三类培养基 基本培养基：（MM，minimal medium）仅能满足某微生物的野生型菌株生长需要的最低成分组合培养基，可用-表示。 完全培养基：（CM，complete medium）可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基，可用+表示。 补充培养基：（SM，supplemental medium）只能满足相应的营养缺陷型菌株的生长需要的组合培养基，可用A或B表示。 与营养缺陷型突变有关的三类遗传型个体 野生型（wild type）从自然界分离到的任何微生物在其发生营养缺陷突变之前的原始菌。其遗传型可用A+B+表示。,营养缺陷型（auxotroph）野生型菌株经诱变处理后，丧失了代谢途径中某种酶的合成能力，只能在加有该酶合成产物的培养基上才能生长，此类突变菌株，称为营养缺陷型菌株。B营养缺陷型的遗传型可用A+B-表示，A营养缺陷型则可以用A-B+表示。 原养型（prototroph）营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求上与野生型相同，均为A+B+。 营养缺陷型的筛选方法 诱变处理 淘汰野生型： 抗生素法：青霉素适用于细菌，制霉菌素适用于真菌。 菌丝过滤法：适用于丝状生长的真菌和放线菌。, 检出缺陷型： 夹层培养法：4层 限量补充法：加入微量（0.01%以下）的蛋白胨或相应物质。 逐个捡出法：CM和MM平板上对应点种。 影印接种法： 鉴定缺陷型： 生长谱法（auxanography）： 菌液MM微量营养物,