【基金标书】2010CB945600-组织干细胞的干性维持、分化控制和免疫调节研究

项目名称： 组织干细胞的干性维持、分化控制和免疫调节研究首席科学家： 时玉舫 中国科学院上海生命科学研究院起止年限： 2010 年 1 月-2014 年 8 月依托部门： 中国科学院 上海市科委一、研究内容1、组织干细胞静息和活化状态的转换及多潜能性研究研究干细胞静息和活化状态的转换，评价其分化的多潜能性，以认识组织干细胞的干性维持机制。拟应 用已知的可能的组织干细胞的标志，制备组织干细胞遗传标记小鼠模型或进行离体标记，以显微切割系统进行单细胞水平的分离，利用已建立的组织干细胞长期培养观察系统进行培养观察，借助 SOLiD TM 技术平台对组织干细胞进行单细胞表达谱分析，以识别和鉴定组织干细胞，识别静息和活化的组织干细胞的特征， 发现不同状态下组织干细胞的特异性分子标志，掌握静息和活化状态转换的分子机制；研究免疫因子对组织干细胞干性维持的影响及其机制；通过比较不同阶段的多潜能干细胞和单潜能前体细胞的 mRNA 和蛋白质表达谱以及表观遗传学谱，确定组织干细胞在遗传及表观遗传方面的特性标志，分析维持组织干细胞多潜能性的遗传和表观遗传作用机制，揭示组织干细胞干性维持的规律。2、组织干细胞分化启动和分化定向研究研究分化启动关键因子、抑分化因子和促分化因子平衡、免疫因子与分化的相关性、分化过程的阶段特性，以及异位再殖的分化特性。拟采用活体组织中干细胞遗传标记及其谱系示踪模型小鼠，制 备组织干细胞分化模型，在不同的时间点（即不同的分化阶段）直接从活体中采取标记细胞和组织标 本，采用原位和离体的方法对组织干细胞分化活动的过程及其调控进行具有 时空特性的综合研究，其中包括：组织干细胞分化进程中结构空间特性的认识 、不同分化阶段特征的鉴别、分化启动和分化定向关 键调控因子的鉴定。在此基础上，也 进行不同胚层来源的组织的组织干细胞之间的比较研究，以 认识分化事件 调控的基本规律。3、组织干细胞分化的遗传及表观遗传调控机制研究研究与组织干细胞分化相关的关键因子的遗传和表观遗传调控机制，加深对组织干细胞分化调控基本规律的认识。拟采用遗传学和表 观遗传学研究体系，探讨已知的表观调控因子（包括组蛋白修饰分子、染色 质 重塑分子和 microRNA）的生物学功能和作用机制；发现和鉴定新的表观遗传调 控因子及其作用机制；研究免疫因子对组织干细胞分化的遗传及表观遗传调节的影响及其机制；运用生物信息学方法，整合不同层次的数据（ mRNA、转录因子、microRNA 和表观遗传调控相关分子），探索组织干细胞分化调控规律， 为干预组织干细胞的分化提供依据。4、组织干细胞免疫调节研究研究组织干细胞的免疫生物学特性及机体免疫因素对组织干细胞的调控。拟利用功能基因组和蛋白质基因组高通量平台分析不同状 态和阶段的组织干细胞免疫相关分子表达差异，明确组织干细胞免疫相关分子及其功能的 识别和鉴定标志，研究免疫因子对组织 干细胞干性维持、分化和免疫功能的影响， 发现关键的免疫调控因子及其作用机制。 进而在组织损伤和疾病 动物模型中，研究机体微环境免疫因素对植入和内在的组织干细胞的激活、 动员 、向损伤靶组织定向迁移、分化、生长 和凋亡的作用及其机制， 发现干预调 控靶点。研究组织干细胞移植对组织损伤和疾病动物的免疫影响和损伤修复作用，同时也研究间充质干细胞等移植可能产生的副作用，并研究 组织干细胞移植的免疫排斥及可能的干 预手段，探讨组织干细胞移植修复治 疗及再生医学的新策略。二、预期目标总体目标以发现组织干细胞生物学的基本规律，发展精准调控组织干细胞的新策略，并将其应用于修复组织和治疗疾病为最终目标。本着“突出我国 领域优势，着重解决符合重大需求的关 键问题、瞄准国际基础理论前沿” 的原则，立足于中国科学院干细胞重点 实验室和上海干细胞研究所，并在我们研究已取得重要突破的基础上，利用项目组具有特色的技术平台和研究体系，研究组织干细胞发 育的多潜能性、分化 调控 过程及其与机体免疫的交互作用，多层次地分析组织干 细胞干性维持，分化启 动 及分化调控、免疫 调控等关键制动节点。以期阐明组织 干细胞干性维持、分化启动和分化定向的关键分子机制，确定其干预调控靶点，深入理解组织干细胞调控网 络。 认识组织干细胞与机体免疫交互作用的规律，为组织干细胞安全有效地应用于组织修复和疾病治疗，提供重要理论基础和技术支撑。进一步加快我国干细胞研究与再生医学、免疫和分子遗传等领域的衔接和交叉，形成高水平的学术研究人才梯队。五年目标与预期突破：1、确定组织干细胞静息及活化状态的识别标志，揭示组织干细胞干性维持的规律建立组织干细胞静息和活化状态的指纹图谱，确定组织干细胞的细胞编程差异及干细胞静息与活化状态的识别标志，发现组织干细胞共性及特性标志。研究并发现调控组织干细胞静息与活化状态的关键因子及多潜能性维持的遗传及表观遗传规律。并揭示不同 组织的组织干细胞及其在体外和体内环境下干性维持的异同。通过对组织干细 胞活化异常的干预研究，为干细胞疗法提供新的药物靶标。2、发现组织干细胞分化启动和分化定向的关键调控因子，明晰组织干细胞分化途径建立组织干细胞的遗传标记和分化谱系示踪的技术体系，实现分化阶段的划分及其 mRNA、microRNA 和蛋白质水平指纹图谱的建立，发现分化启动及其后续各主要分化阶段的关键调控因子，并绘制可以反映主要分化方向和主要分化等级的分子“ 分化树” ，以丰富组织干细胞的分化过程及其分化调控分子基础方面的知识体系，进而为活体中组织干细胞分化行为人为干预体系的建立提供理论基础。3、阐明组织干细胞分化的遗传和表观遗传调控机制，认识组织干细胞分化调控规律阐明与组织干细胞分化相关的关键因子的遗传和表观遗传调控机制；发现和鉴定新的表观遗传调控分子；整合不同层次的数据（mRNA 、转录因子、microRNA 和表 观遗传调 控相关分子）， 认识组织干 细胞分化调控网络。为干预组织干细胞的分化提供依据。4、阐明组织干细胞与机体免疫因素的相互作用影响，提供组织干细胞移植治疗的免疫评价指标和免疫调节新策略筛选并确定组织干细胞特异性表达的免疫相关分子，建立组织干细胞免疫学功能的识别鉴定体系，发现调控组织干细胞免疫功能的关键因子。建立研究组织干细胞迁移的技术体系， 认识组织干细胞迁移的特征。阐明组织干细胞与机体免疫因素的相互作用及其分子机制，发现免疫干预调节的关键靶点，提供免疫调节新策略。基于以上目标，本项目将发表 SCI 收录的学术论文 100 篇以上，其中在相关领域的国际权威刊物上发表论文 30 篇以上，申报发明专利 30 项，取得具有国际影响的原创性成果 3-5 项，培养硕博士研究生 30-50 名；并形成组织干细胞领域的杰出人才梯队。三、研究方案学术思路本项目针对制约组织干细胞研究和应用的理论瓶颈问题，以“ 确定组织干细胞静息状态、活化状态及分化 过程的识别标志、揭示组织干细胞干性维持的规律、认识组织干细胞分化启动和分化定向的机制、阐明组织干细胞分化的调控网络及其遗传和表观遗传机制和建立组织干细胞移植修复治疗中免疫影响的评价和调控体系”为 研究目标，集成细胞和分子生物学、表观遗传学、基因组学、转录组学、蛋白质组学及生物影像学、免疫学、生物信息学等优势学科力量，开展多学科交叉综合性研究，集中攻关关键科学问题。依据 组织 干细胞生物学活动的过程，以研究组织干细胞静息和活化状态的转换及多潜能性为起点，探索组织干细胞分化启动和分化定向的关键分子和靶点、分化调控网络及其遗传和表观遗传调控机制，进而研究组织干细 胞与机体免疫的相互作用，以深入理解组织干细胞分化调控的基本规律以及组织干细胞移植的免疫调控机制，为组织干细胞临床应用奠定重要理论基础。技术途径1. 利用相关组织干细胞的分子标志，建立组织干细胞遗传标记的基因工程小鼠品系，以形成活体组织遗传标记和分化谱系示踪的研究平台。2. 采用已建立的细胞显微成像技术、单细胞激光捕获技术和单细胞表达谱研究分析平台系统，在单细胞水平对组织干细胞进行识别鉴定、静息与活化状态转换和多潜能性维持机制的研究。3. 利用组织干细胞遗传标记的基因工程小鼠品系，制备相应的分化模型，在不同的时间点直接从体内采取标记细胞及相应的组织标本进行mRNA、microRNA、蛋白质 、细胞及组织水平的分析。进而利用 RNA 干扰和基因敲除的技术体系，研究所发现的关键分子在组织干细胞分化中的作用。4. 采用 ChIP-chip (seq)、MeDIP-chip (seq)技术和 microRNA 深度测序技术分析不同组织干细胞表观遗传差异，建立它们的表观遗传指纹图谱，进而达到对其进行识别和鉴定的目的。5. 通过 DNA 甲基化检测、染色质免疫共沉淀、组蛋白密码分析、染色质重塑分子基因敲除等方法，探讨 DNA 甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑等表观遗传调控在组织干细胞分化中的作用。6. 运用生物信息学方法，整合不同层次的数据（mRNA 、转录因子、microRNA和表观遗传调控相关分子），认识组织干细胞分化相关的调控网络。7. 利用功能基因组和蛋白质组高通量分析平台，建立组织干细胞免疫学功能的识别鉴定体系。运用趋化因子及其受体分析平台，研究组织干细胞的迁移特征与分子调控机制。8. 利用多种组织损伤和疾病动物模型，研究组织干细胞移植的免疫影响和损伤修复作用，同时研究组织损伤和疾病状态时，机体免疫因素对组织干细胞的免疫相关分子表达、动员、激活、趋化迁移、分化、生长和凋亡等的影响。以上各研究内容相对独立，而同时密切配合，交叉互用，形成一个有机整体。创新点和特色：本项目针对组织干细胞的干性维持、分化启动、分化定向和组织干细胞与机体微环境之间的相互影响等关键科学问题进行系统研究，其在理论上和技术上的创新与特色，主要体现在以下几个方面：1、静息状态组织干细胞的基本特性。采用已建立的组织干细胞遗传标记技术体系， 结合先进的细胞成像技术、 单细胞激光捕获 技术，以及 SOLiD TM单细胞表达谱研究分析平台系统，构建静息与活化状态的组织干细胞的指纹图谱，探寻可用于其识别和鉴定的特异性分子标志，以此进一步探讨和阐明组织干细胞静息和活化状态相互转换和组织干细胞多潜能性维持的分子基础与调控机制。同时结合上述研究，采用组织 干细胞体外培养体系， 进 一步探讨组织干细胞体内及体外的生物学行为异同性。2、活体组织干细胞分化行为的时空特性。采用基于 Cre-loxP 的基因工程小鼠技术体系，进行组织干细 胞活体内遗传标记，及其后续分化谱系的示踪。并采用原位和离体的分析技术，建立不同分化阶段的指纹图谱，探寻组织干细胞分化启动和分化定向的关键调控因子，绘制组织干细胞“ 分化树”，从时间和空间的角度，解析组织干细胞分化过 程及其调控作用的分子基础。同时也进行体外组织干细胞分化的研究，进一步分析 组织干细胞体内、体外分化行为的特点。3、组织干细胞分化调控的基本规律。 采用遗传学、表观遗传学和生物信息学的研究体系，探讨调控组织 干细胞分化启动和分化定向等的关键因子及作用机制。进而整合不同角度的研究数据（mRNA 、转录因子、microRNA 和表观遗传调控相关分子），认识组织干细胞分化调控网络，探索组织干细胞分化调控机制的基本规律，为干预组织干细胞分化提供依据。4、组织干细胞与机体微环境的交互作用。 结合研究组织干细胞对机体修复和免疫调控作用，同时观察机体局部微环境对前者分化发育和功能的调控影响，是本项目的又一新特色。在此基础上， 进一步围绕免疫微环境对组织干细胞的迁移和募集作用，研究病生理状态下， 趋化因子及其受体以及黏附分子等对组织干细胞的动员和招募调控机制，构建组织干细胞趋化因子受体表达谱，以此进一步分析组织干细胞的靶向趋化效应。通过上述几个关键问题的研究，若达预期目标，本 项目不仅突显了在组织干细胞生物学研究领域的原创性，也将丰富和充实干细胞生物学的知识体系，为组织干细胞在细胞治疗和再生医学中的应用奠定新的理论基础。可行性分析本项目依据组织干细胞最新研究动态和发展前景，立足于已有工作基础和技术平台， 围绕“ 组织干细胞的干性 维持、分化控制及免疫调节”的重大科学问题，经过充分科学论证，展开系 统研究，从而保证该项目的立项和实施的可行性。1、研究队伍：本项目组成员均为来自国家及部门干细胞等重点实验室的科研一线优秀中青年专家，已在干细胞、免疫学、细胞和分子生物学以及 结构和功能基因组学研究等方面取得了具有国际影响力的学术成绩。拟推荐的首席科学家时玉舫教授是中央组织部首批“引进海外高层次人才” ，各课题负责人也都在组织干细胞领域有突出成就，承担和完成了多项国家、省部级的相关研究课题， 有深厚的研究造诣和丰富的课题管理经验。2、工作积累：本项目组成员多年从事干细胞及相关领域的系统研究，具有较丰富的工作积累和取得了一批重要的创新突破，为本项目的实施奠定了坚实的基础。在国 际上首次分离培养了鼠肝干 细胞系， 证明了其具有肝向和胆向分化的潜能，以及再殖损伤肝脏的能力（ Stem Cells. 2006, 24: 322），在此基础上，进一步发现和提出了其肝向分化启动的“开关效应” 学说；首先在 侧脑室的室管层中发现了处于分化上游（静息活化期）的神经干细胞的存在，并确定其特异性的分子标志（Proceedings of the National Academy of Sciences. 2008, 105: 1026)；采用构建基因剔除动物模型和基因芯片等方法，发现了一批干性维持、自我更新和分化相关基因（Blood. 2009, 113: 1455；Frontiers in Bioscience. 2007, 12: 1691；Journal of Cellular Biochemistry. 2009, 106: 16）。发现人的胚胎干细胞的基因拷贝数指纹图谱在体外培养和分化中可以保持稳定（Stem Cells. 2008, 26: 1484）。这些工作积累为本项目的课题设定和深入研究提供了科学保障。发现影响不同的人胚胎干细胞株分化方向的不同表观遗传特征（Proceedings of the National Academy of Sciences. 2007, 104: 13821）。利用 遗传和表观遗传技术平台，揭示了细胞凋亡调 控基因 TIP30 调控下游基因表达的分子机制（Hepatology. 2008, 48: 265；Cancer Research. 2008, 68: 4133；Clinical Cancer Research. 2008, 14: 7405）。通 过对神经元中甲基化 CpG 结合蛋白 MeCP2 的功能研究，首次确定其结合靶基因 脑源性神经营养因子基因 BDNF（Science. 2003, 302: 890）。这些表观遗传领 域的研究成果为本项目的 实施提供了丰富知识积累。首先发现间充质干细胞免疫调控的体内作用机制（Cell Stem Cell. 2008, 2: 141）及免疫因子诱导干细胞产生细胞生长因子（Stem Cells. 2009, In press）促进了对干细胞的全新认识。早在 1989 年即提出了激活诱导细胞死亡的重要学说（Nature. 1989, 339: 625）。首次成功地在体外用胚胎肝造血干细胞诱导分化了树突状细胞（dendritic cells，DC），并发现胚胎时期 DC 和自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）细胞分化途径和可逆性 转变及其关 键调控因子（Blood. 2000, 95: 138）。首先通过趋化因子直接招募大量 DC 前体细胞以制备疫苗，开拓了趋化因子研究的新领域（Journal of the National Cancer Institute. 2004, 96: 201；Journal of Leukocyte Biology. 2008, 84: 1549）。发现骨髓干 细胞移植后的 GVHD 病程发展与异体反应 T 细胞表达的趋化因子受体的调控作用密切相关（ Journal of Immunology. 2008, 181: 7581）。这些是组织干细胞免疫特性及其与机体免疫交互影响研究的重要学术思想源泉和进一步取得创新突破的基石。在生物信息学方面，建立了多种生物信息学模型(Bioinformatics. 2003, 19: 2161 )，并将生物学信息学成功地 应用到了生物具体问题中 (Journal of Biological Chemistry. 2004, 279: 2719；Human Mutation. 2009, In press 等) 。这些为本项目的跨学科合作提供了经验和基础。3、技术平台和仪器设备：本项目组拥有较成熟的技术平台和先进的仪器设备。如基于转基因/基因剔除模型、RNA 干扰技术、自动 DNA 测序仪和高通量芯片的基因功能组学平台；原位遗传标记技术、单细胞水平高通量显微分离和SOLiD TM单细胞表达谱研究平台；DNA 甲基化分析系 统、 ChIP-chip (seq)、MeDIP-chip (seq)技术和 microRNA 深度测序技术；活体荧光成像仪，激光共聚焦显微镜、投射/扫描电镜等 细胞影像分析平台；多色高速流式 细胞仪、SPF 级的动物研究室、干细胞培养室。4、组织形式：瞄准战略目标，追求持 续发展，开展系统化研究。项目组织管理和运作体制分项目和课题两个层次。项目设一名负责人，负责整个项目的组织和实施。 项目负责人聘请各相关科学领域成就卓著的专家组成项目专家组，参与项目的组织、运行领导和管理，协助项目负责人，审 核和确定项目的学术思想、技术路线以及研究计划，指 导协调各课题的工作，督促并考核各课题的进展情况。实施整体性运作方案，集成 发展技术平台，充分 发挥项 目各课题组及承担单位的学科优势和关键研究实力，形成功能配套、布局合理、机制灵活、锐意进取的研究体系。各课题间的关系根据本项目的总体研究方案，以研究组织干细胞的干性维持、分化过程及其与机体免疫的交互作用为核心，针对关键问题选择突破点，将项目设臵为四个课题。课题 一，利用活体内干细胞遗传标记和分化谱系示踪技术以及单细胞分离和分析平台系统，建立静息及活化的组织干细胞的分子标志系统，研究调控组织干细胞静息与活化状态转换和多潜能性维持的机制，揭示组织干细胞干性维持的规律；课题二，利用特定的分化模型，研究组织干细 胞分化启动及其分化定向的分子基础，探索关键因子在分化命运决定中的作用；课题三，利用染色质免疫共沉淀芯片、甲基化 DNA 免疫沉淀芯片等技 术，研究 组织干细胞分化调控的遗传和表观遗传调控机制，并利用生物信息学手段，构建 组织干细胞的调控网络模型，阐明组织干细胞分化的规律；课题四，利用活体示踪体系及组织损伤和疾病动物模型，研究组织干细胞体内迁移模式、组织干细胞与机体免疫系统的交互作用及调控靶点，并进一步探讨组织 干细胞移植治疗和再生医学的新策略。课题 1 ： 组织干细胞静息和活化状态的转换及多潜能性研究 研究目标： 本课题拟利用高分辨率显微分离系统、活细胞显微成像和单细胞深度测序技术，对组织干细胞进行单细 胞分离和表达谱分析，以识别和鉴定组织干细胞的静息与活化状态，建立指纹图谱， 进而建立静息和活化的组织干细胞的分子标志系统；比较肝脏、间充质、神经和乳腺等不同组织的 组织干细胞共性与特性。 进行 mRNA 和蛋白质表达谱以及表观遗传学谱分析，揭示组织干细胞在静息和活化状态之间转换和多潜能性维持的关键因子及其作用机制。进一步还将研究不同组织的组织干细胞及其在体外和体内环境下干性维持的异同。本课题将为调控组织干细胞的静息和活化状态提供理论基础，并为干细胞替代疗法和药物研发提供新思路。 研究内容： 研究干细胞静息和活化状态的转换，评价其分化的多潜能性，以认识组织干细胞的干性维持机制。拟应 用已知的可能的组织干细胞的标志，制备组织干细胞遗传标记小鼠模型或进行离体标记，以显微切割系统进行单细胞水平的分离，利用已建立的组织干细胞长期培养观察系统进行培养观察，借助 SOLiD TM 技术平台对组织干细胞进行单细胞表达谱分析，以识别和鉴定组织干细胞，识别静息和活化的组织干细胞的特征， 发现不同状态下组织干细胞的特异性分子标志，掌握静息和活化状态转换的分子机制；研究免疫因子对组织干细胞干性维持的影响及其机制；通过比较不同阶段的多潜能干细胞和单潜能前体细胞的 mRNA 和蛋白质表达谱以及表观遗传学谱，确定组织干细胞在遗传及表观遗传方面的特性标志，分析维持组织干细胞多潜能性的遗传和表观遗传作用机制，揭示组织干细胞干性维持的规律。 经费比例： 20% 承担单位： 同济大学 课题负责人： 刘小青 学术骨干： 吴昊、陈炳官、袁琼兰、罗玉萍、 杨胜东、李惠萍 课题 2 ： 组织干细胞分化启动和分化定向的研究 研究目标： 本课题拟采用组织干细胞的遗传标记和分化谱系示踪的手段，利用特定的分化模型，在不同的时间点上直接采取标记细胞和组织标本，从RNA、microRNA、蛋白质 、细胞和组织等不同层面或角度，对组织干细胞分化启动及其分化定向的分子基础进行探讨，发现决定分化命运的关键分子及其相互关系，并绘制反映主要分化方向和分化等级的分子“ 分化树”，以丰富组织干细胞生物学中关于分化启动与分化定向的调控机制、分化阶段的判断，以及组织干细胞异位分化的调控因素等方面的知识体系。 研究内容： 研究分化启动关键因子、抑分化因子和促分化因子平衡、免疫因子与分化的相关性、分化过程的阶段特性，以及异位再殖的分化特性。拟采用活体组织中干细胞遗传标记及其谱系示踪模型小鼠，制备组织干细胞分化模型，在不同的时间点（即不同的分化阶段）直接从活体中采取标记细胞和组织标本，采用原位和离体的方法对组织干细胞分化活动的过程及其调控进行具有时空特性的综合研究，其中包括：组织干细胞分化进程中结构空间特性的认识、不同分化阶段特征的鉴别、分化启动和分化定向关 键调控因子的鉴定。在此基础上，也 进行不同胚层来源的组织的组织干细胞之间的比较研究，以认识分化事件调控的基本规律。 经费比例： 25% 承担单位： 中国人民解放军第二军医大学、上海交通大学 课题负责人： 胡以平 学术骨干： 诸江、谢志芳、余宏宇、 陈美珏、李文林课题 3 ： 组织干细胞分化的遗传和表观遗传调控机制研究 研究目标： 阐明与组织干细胞分化相关的关键因子的遗传和表观遗传调控机制，发现和鉴定新的表观遗传调控分子，整合不同层次的数据（mRNA 、转录因子、microRNA 和表 观遗传调 控相关分子），构建不同胚 层来源的组织的组织干细胞分化调控网络模型，为干预组织干细胞的分化提供依据。 研究内容： 研究与组织干细胞分化相关的关键因子的遗传和表观遗传调控机制，加深对组织干细胞分化调控基本规律的认识。拟采用遗传学和表观遗传学研究体系，探讨已知的表观调控因子（包括组蛋白修饰分子、染色质重塑分子和 microRNA）的生物学功能和作用机制；发现和鉴定新的表观遗传调控因子及其作用机制；研究免疫因子对组织干细胞分化的遗传及表观遗传调节的影响及其机制；运用生物信息学方法，整合不同层次的数据（mRNA 、转录因子、microRNA 和表观遗传调控相关分子），探索组织干细胞分化调控规律， 为干预组织干细胞的分化提供依据。 经费比例： 20% 承担单位： 中国人民解放军第二军医大学、中国科学院上海生命科学研究院 课题负责人： 赵健 学术骨干： 沈百荣、张岩、陆斌、刘祖梅、周娟、王建永 课题 4 ： 组织干细胞免疫调节研究 研究目标： 本课题拟着重研究组织干细胞与机体免疫的交互作用及其分子机制。基于已建立的功能基因组和蛋白质组高通量技术平台，筛选并明确不同阶段组织干细胞免疫识别相关的特异性分子标志，发现调控组织干细胞免疫功能的关键因子；采用细胞示踪技术，研究 组织干细胞的体内迁移模式；在组织损伤和疾病动物模型体内研究免疫因素与组织干细胞的交互作用及其影响。以期建立组织干细胞免疫学功能的识别鉴定体系和组织干细胞迁移及功能示踪的技术体系，阐明组织干细胞的免疫调控分子机制，发现干预调节的新靶点和提供免疫调控的新策略。 研究内容： 研究组织干细胞的免疫生物学特性及机体免疫因素对组织干细胞的调控。拟利用功能基因组和蛋白质基因组高通量平台分析不同状 态和阶段的组织干细胞免疫相关分子表达差异，明确组织干细胞免疫相关分子及其功能的 识别和鉴定标志，研究免疫因子对组织 干细胞干性维持、分化和免疫功能的影响， 发现关键的免疫调控因子及其作用机制。 进而在组织损伤和疾病 动物模型中，研究机体微环境免疫因素对植入和内在的组织干细胞的激活、动员、向损伤靶组织定向迁移、分化、生长和凋亡的作用及其机制， 发现干预调 控靶点。研究组织干细胞移植对组织损伤和疾病动物的免疫影响和损伤修复作用，同时也研究间充质干细胞等移植可能产生的副作用，并研究组织干细胞移植的免疫排斥及可能的干预手段，探讨组织干细胞移植修复治疗及再生医学的新策略。经费比例： 35% 承担单位： 中国科学院上海生命科学研究院、中国人民解放军第二军医大学 课题负责人： 时玉舫 学术骨干： 张雁云、杜艳芝、卫立辛、张晓玲、于 凤海、金敏、刘强 四、年度计划时 间研究内容 预期目标第一年1、 以显微切割系统分离 CD133 基因位点带 GFP 遗传标记的不同来源的多种组织干细胞。2、 对单个 CD133+细胞进行长期培养观察，测定克隆形成的过程，并结合免疫荧光染色对子代细胞的去向进行可能的标签跟踪，确定 CD133+中组织干细胞的比例。3、 借助 SOLiDTM 技术平台对CD133+组织干细胞进行单细胞表达谱系统分析，包括建立转录图谱以及表观遗传谱。4、 建立组织干细胞特异分子标志基因（如肝干细胞的 Foxl1）的启动子所驱动的 GFP 的转基因小鼠品系；5、 建立干细胞动员和分化的小鼠模型，比较分析分化前后表达谱差异，筛选抑分化基因；1、 建立和完善不同来源的多种CD133+组织干细胞的筛分方法。2、 确定不同组织来源的 CD133+细胞中组织干细胞的比例。3、 在单细胞水平上建立组织干细胞在静息、活化状态转换的转录图谱以及表观遗传谱，以识别和鉴定组织干细胞，发现可用于鉴别不同状态下的组织干细胞的特异性分子标记，从而为揭示组织干细胞的静息和活化状态转换的分子机制提供重要信息。 4、 得到组织干细胞遗传标记的小鼠品系；5、实现组织干细胞从分化模型中的分离、富集及其表达谱分析；6、 建立干预分化模型小鼠的慢病毒干扰系统；7、获得抑分化因子与干细胞分化启动的相关性信息；6、 构建慢病毒干扰载体，以用于分化模型小鼠的干预处理，观察抑分化基因被 knock-down 后对活体组织中干细胞动员的影响；7、 观察抑分化候选因子在组织干细胞分化进程中的表达特点，分析抑分化因子与干细胞分化启动的相关性。8、 利用已经建立的肝干细胞、神经干细胞、间充质干细胞分离和鉴定的技术平台，探讨Hes1、FoxL1、Fbxw7、Xbp1、Nestin、GFAP 等重要转录因子在组织干细胞分化中的转录和转录后调节机制；9、 建立 NanogLoxP/小鼠模型；10、 对已经构建成功的 Mll5 基因敲除小鼠进行初步分析，利用组织化学与免疫生物学等方法，检测 Mll5 基因敲除后肝、神经、间充质、乳腺等组织干细胞的变化；8、 建立研究转录和转录后调控机制的相关实验体系和技术平台；9、 建立 NanogLoxP/小鼠模型为探讨 Nanog 在 组织干细胞分化调控中的作用奠定基础；10、 初步探讨 Mll5 染色质重塑分子在组织干细胞分化中的作用；11、 筛查与组织干细胞分化相关的关键 miRNA 分子；12、 建立组织干细胞体外和体内分析系统，为后期分析组织干细胞在不同阶段的免疫相关分子的表达情况建立技术平台；13、 了解组织干细胞对 DC 分化、成熟和功能的调控作用，为进一步了解其作用机理奠定基础。14、 发表 SCI 收录的学 术论文14 篇，其中在相关领域的国际权威刊物上发表 3 篇，培养研究生8 名。11、 通过大规模、高通量的深度测序（Deep-sequencing）的方式分析肝、神经、间充质等若干重要组织干细胞的 small RNA 表达谱式, 运用单细胞 Real-time PCR 的方式验证分析 miRNA 在不同类群组织干细胞中的表达分布特征。12、 利用功能基因组平台和蛋白质组平台，建立组织干细胞体外和体内分析系统；13、 将不同状态和阶段的组织干细胞加入到 DC 培养系统中， 观察组织干细胞对 DC 分化、成熟和功能的调控作用。14、 研究间充质干细胞移植的副作用第二年1、 建立在表达图谱上有重大或特异差异的基因的功能缺失或获得模型。2、对以上建立的模型进行静息、活化状态的鉴定，确定特异表达的分子标签是维持组织干细胞功能1、 确定组织干细胞干性维持、静息和活化状态的关键因子。2、 揭示机体微环境对组织干细胞的静息与活化状态相互转换及其多潜能性的调节机制。所必须的关键因子。3、 利用体内各种基液(如脑积液)对不同来源的组织干细胞处理，研究其对组织干细胞静息与活化状态的相互转化及潜能性的维持的作用机制。4、 将携带报告基因 Roser26R-LacZ /Roser26R-GFP 的小鼠与干细胞特异分子标志基因的启动子所驱动的 Cre 小鼠 杂交，以获得可用于干细胞标记和其分化谱系示踪的小鼠品系，并制备相应干细胞的分化模型；5、 在模型制备过程中的不同时间点，利用流式细胞技术等手段直接从活体组织中分离被遗传标记的细胞，进而进行 mRNA 和microRNA 表达 谱的分析，以构建各个分化阶段的指纹图谱；6、 收集各相应时间点的组织标本，进行原位分析，以追踪其组织干细胞的分化命运，并构建其干细3、 得到干细胞遗传标记和其分化谱系示踪的小鼠品系；4、绘制组织干细胞各个分化阶段的指纹图谱； 5、 完成可反映组织干细胞主要分化方向和主要分化等级的分子“分化树”；6、阐明转录和转录后调控在组织干细胞分化调节中的作用；7、 初步探讨 Nanog 基因在组织干细胞损伤修复中的作用。8、 初步探讨 Mll5 基因在组织干细胞损伤修复中的作用；9、 探讨关键 miRNA 在组织干细胞分化中的作用及其作用机制；10、 了解组织干细胞在不同阶段的免疫相关分子的表达情况；11、 阐明组织干细胞对 DC 分化、成熟和功能调控的作用机理；12、 了解组织干细胞与 T 细胞等免疫细胞的相互作用，重点阐明组织干细胞对 T 细胞的影响方式。胞的“分化树 ”。7、继续对重要转录因子在组织干细胞分化中的转录和转录后调节机制进行研究；8、对建立的 NanogLoxP/小鼠模型进行初步分析，根据小鼠表型选取不同时间段处死小鼠，收集各种组织器官，进行表型观察和病理切片；9、 利用手术、伽马射线或者化疗药物制造组织损伤，检测 Mll5 基因敲除后，组织干细胞在损伤修复过程中的变化；10、 通过过表达、基因敲低及可诱导的 miRNA 转基因模型研究组织干细胞分化过程中关键miRNA 的作用及其作用机制。11、 利用已建立的平台技术分析组织干细胞在不同阶段的免疫相关分子的表达情况；12、 针对已发现的组织干细胞对 DC 分化、成熟和功能的调控作用，进一步深入研究其中的作13、 发表 SCI 收录的学 术论文16 篇，其中在相关领域的国际权威刊物上发表 3 篇，申请专利 3项，培养研究生 14 名。用机理；13、 在研究组织干细胞与 DC 细胞相互作用的基础上，进一步研究组织干细胞与 T 细胞的相互作用，检测组织干细胞对 T 细胞增殖及细胞因子分泌格局的影响。14、 研究组织干细胞移植的副作用第三年1、 建立多潜能组织干细胞和单潜能前体细胞的 mRNA 转录图和表观遗传学谱。2、 从分化早期即发生改变的基因（从 mRNA 和 microRNA 水平）着手，结合 Go 功能聚类和pathway 聚类，筛选出候选的分化启动和分化定向的关键因子；3、 采用基因功能丢失或基因功能获得等策略，从体外和体内两个方面，逐个分析各候选关键因子对遗传标记的组织干细胞多向分化的影响；4、 分析各种候选关键因子的不同1、 揭示多潜能组织干细胞和单潜能前体细胞的分子指纹图谱，找出各自反应其潜能性的特异性分子标签。2、 获得候选分化启动和分化定向的关键因子；3、 明确各候选关键因子对遗传标记细胞分化启动和分化中的作用； 4、 认识各种关键因子间的协同作用；5、 探讨 DNA 甲基化在组织干细胞分化中的作用；6、 阐明 Nanog 基因调节组织干细胞分化的分子机制；组合对组织干细胞分化行为的影响。5、 通过亚硫酸氢钠修饰、MSP 和BSP 测 序的方法，检测 DNA 甲基化在肝干细胞、神经干细胞和间充质干细胞分化中的作用；6、 利用原位杂交，免疫组化， Real-time PCR 和 Western blotting 等方法分别在 RNA 水平和蛋白质水平上详细分析 Nanog 基因上下游相关分子表达情况及其它相关重要信号通路分子表达情况，从而确定 Nanog 基因在组织干细胞分化中的作用机制。7、 进一步探讨 Mll5 在组织干细胞损伤修复中的作用和作用机制；8、 构建斑马鱼重要组织如肝脏、心脏等干细胞特异转录因子驱动的 GFP 表达的转基因斑马鱼系，通过绿色荧光蛋白示踪其组织干细胞的分布，建立干细胞在体迁移及功能示踪的技术体系。9、 进一步分析比较组织干细胞对7、 阐明 Mll5 基因在组织干细胞损伤修复中的作用及作用机制；8、 建立干细胞在体迁移及功能示踪的斑马鱼技术体系；9、 阐明组织干细胞对调节性 T 细胞转化、淋巴细胞杀伤能力等的不同作用及其机理；10、 发现若干调控组织干细胞的免疫调控因子及其组合，并弄清其作用方式。11、 发表 SCI 收录的学 术论文23 篇，其中在相关领域的国际权威刊物上发表 6 篇，申请专利 5项，培养研究生 17 名。调节性 T 细胞转化、淋巴 细胞杀伤靶细胞的能力等的影响；10、 单独或联合应用各种免疫调控因子刺激组织干细胞，检测和比较刺激前后组织干细胞免疫相关分子的表达差异，分析其增殖能力变化和自身细胞因子分泌格局。11、 研究组织干细胞移植的副作用。第四年1、 建立潜在的反应组织干细胞的多潜能性的特异分子标签的基因敲除或 RNA 表达干涉或功能获得模型模型。2、 对以上建立的功能缺失或功能获得的模型进行潜能性测定。确定哪些特异表达的分子标签是维持组织干细胞多潜能功能所必须的关键因子。 3、 将不同来源的组织干细胞分别植入 FAH-/-小鼠，在不同时间点观察植入细胞的效率、空间分布以及成熟肝细胞功能标志，评1、 确定特异表达的分子标签是维持组织干细胞多潜能功能所必须的关键因子。2、 明确不同来源组织干细胞的再殖能力与再殖特点；3、 明确组织干细胞再殖部位所浸润的免疫细胞的类型；4、发现可以干预干细胞再殖效率的影响因子；5、 探讨组蛋白修饰在组织干细胞分化中的调控；6、阐明 miRNA 在斑马鱼肝脏、心脏再生中的作用；价不同来源细胞的再殖能力与再殖特点。4、 研究骨髓间充质干细胞在肝脏中的再殖情况，其中包括肝向分化的阶段划分、各个分化阶段的指纹图谱，以及处于不同分化阶段的干细胞异位再殖潜力。5、 针对一些特别的因子，对拟用于移植的细胞用基因功能丢失或基因功能获得等手段处理，然后再将其植入 FAH-/-小鼠，评价其对再殖效率的影响。6、 结合各组织来源的间充质干细胞植入后不同时期形态学和不同种类淋巴细胞的特异性免疫学标记，分析参与免疫反应的淋巴细胞种类，以发现主导细胞移植免疫反应的免疫细胞类型。7、 利用组蛋白修饰的特异抗体，进行染色质免疫沉淀，分析肝脏、间充质、神经和乳腺等组织干细胞中重要转录因子启动子区域7、 探索组织干细胞分化调控的基本规律。8、 明晰组织干细胞免疫学功能相关的识别和鉴定标志；9、阐明有效免疫因子或其组合对组织干细胞的作用机制；10、 建立和完善趋化因子及其受体的分析技术平台，阐明组织干细胞的迁移特征与分子调控机制。11、 发表 SCI 收录的学 术论文25 篇，其中在相关领域的国际权威刊物上发表 10 篇，申请专利10 项，培养研究生 22 名。的组蛋白修饰特征，明确这些基因在组织干细胞分化中表达变化的调控机制。8、 利用 miRNA 芯片技术， 获得斑马鱼心脏、肝脏再生过程中miRNA 的动态的表达变化谱式，再结合敲除特异 miRNA, 研究单个 miRNA 对于干细胞介导的再生过程的影响。9、 通过动态贝叶斯网络方法建立组织干细胞的遗传学和表观遗传学调控网络,探索组织干细胞分化调控的基本规律。10、 分别将不同阶段的组织干细胞移植到组织损伤的动物体内，研究体内的组织干细胞免疫相关分子表达，并对比体外培养体系中不同阶段的组织干细胞免疫相关分子表达的差异，分析组织干细胞在不同阶段特异性表达的免疫相关分子；11、 基于前期研究筛选出有效调控组织干细胞的关键因子，并阐明其作用机制。12、 在组织损伤和疾病动物模型中，分析靶组织和组织干细胞的炎症因子、趋化因子及其受体、黏附分子等的表达谱，研究组织损伤后释放的免疫炎症因子对植入和内在的组织干细胞的免疫相关分子表达、动员、激活、分化、生长和凋亡以及向损伤靶组织迁移的影响作用。第五年1. 利用免疫调节因子体内各种基液( 如脑积液) 对不同来源的组织干细胞处理，研究其对组织干细胞静息与活化状态的相互转化及潜能性的维持的调控作用。2. 利用免疫拮抗因子对不同来源的组织干细胞处理，研究其对组织干细胞静息与活化状态的相互转化及潜能性的维持的调控作用。3. 利用生物信息学，对 mRNA 和1、 揭示免疫调节因子及免疫拮抗因子对组织干细胞的静息与活化状态相互转换及其多潜能性的调节机制。2、为干细胞移植克服免疫排斥提供新战略。3、认识组织干细胞分化启动和分化定向的调节模块；4、获得细胞的植入及增殖与免疫细胞之间的认识；5、 在组织损伤和疾病动物模型体内microRNA 层 面的数据进 行综合分析，分析组织干细胞分化启动和分化定向的关键因子的相互关系；4. 不同组织来源的组织干细胞间分化调控分子基础的横向比较，探讨组织干细胞分化启动和分化调控的基本规律；5. 分析免疫细胞在干细胞植入和增殖过程中的作用及其机制，并评价人为干预的可行性；6. 在组织损伤和疾病动物模型中，研究分析组织干细胞移植对机体免疫的影响作用及其机制；7. 通过检测移植的组织干细胞在靶组织中的存活、分化能力和向各种靶组织细胞分化的比例，确定组织干细胞在体内的分化状态和对靶组织损伤的修复机制；8. 同时研究机体对植入组织干细胞的免疫排斥反应及其机制，探索诱导组织干细胞移植免疫耐受的新手段；研究免疫因素与组织干细胞的交互作用及其影响；6、发现组织干细胞与机体免疫交互作用的规律。 7、发表 SCI 收录的学术论 文 30 篇，其中在相关领域的国际权威刊物上发表 12 篇，申请专利 12 项，培养研究生 22 名。9. 进一步利用转基因或基因剔除等手段改变某些潜在调控因子的表达，研究由微环境中趋化因子和黏附分子分别介导的组织干细胞胞内信号转导，探索组织干细胞在组织损伤和修复治疗中迁移的分子机制。