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第五节 酶的提取纯化与活力测定,一.酶的分离与提取,酶提取基本的方法,细胞产生的酶有二类： 1. 由细胞内产生后分泌到胞外发挥作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大部分属于水解酶。此类酶通常含量高，容易得到。 2. 在细胞内合成后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，该类酶在细胞内往往与细胞器结合，不仅有一定的区域性，而且催化的反应具有一定顺序性。,A. 了解所分离酶在细胞中分布,B. 材料的获取,在提取某一酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料限制，成本又很大，因此，目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。,一.酶的分离与提取,酶提取基本的方法,C. 酶分离纯化的主要步骤,1.主要步骤为：抽提、纯化、结晶 抽提：破碎细胞，动植物组织一般可用组织捣碎器；或者加石英砂研磨，将材料做成丙酮粉或进行冰冻融解 ；对细菌，常采用加砂或加氧化铝研磨和超声波振荡方法破碎。 大多数酶一般都用缓冲液进行抽提，缓冲液的类型决定于酶的种类和理化特性，抽提液pH最好远离等电点 。,一.酶的分离与提取,酶提取基本的方法,C. 酶分离纯化的主要步骤,1.主要步骤：抽提、纯化、结晶 浓缩：抽提液或发酵液中酶浓度往往很低，必须浓缩富集。常用的浓缩方法有：加中性盐或冷乙醇沉淀后再溶解，胶过滤浓缩以及超过滤浓缩法等。 纯化：纯化过程就是去除杂质的过程。原则：一方面是要提高酶的纯度，另一方面却也使酶的总量不可避免有所损失。,一.酶的分离与提取,酶提取基本的方法,C. 酶分离纯化的主要步骤,1. 主要步骤为：抽提、纯化、结晶 结晶：浓缩液经过各种方法的纯化，可得到较纯的结晶产品。,一.酶的分离与提取,酶提取基本的方法,C. 酶分离纯化的主要步骤,2. 选择分离纯化方法 a.盐析法（如硫酸胺） b.有机溶剂沉淀法 c.层析纯化法（葡聚糖凝胶、阴离子交换层析） d.等电点法 e.吸附分离法,一.酶的分离与提取,酶提取基本的方法,1. 酶活力概念,酶活力 是酶促反应的能力。酶活力大小就是指在一定条件所催化的某一化学反应速度的快慢，即酶催化的反应速度越快，酶活力越高，反之则表示该酶活力低。,二.酶活力及其测定,但是，酶的定量并非对其蛋白质进行定量，而是对它的催化能力进行定量。,所以，酶的定量就是测定酶的活力，也即测定酶促反应的速度。,二.酶活力及其测定,1. 酶活力概念,如何测定酶活力？,以产物浓度对反应时间作图，可得到酶促反应速度曲线,注意：初速度的测定是关键，为什么？,二.酶活力及其测定,1. 酶活力概念,可见，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着时间的延长，反应速度逐渐下降,原 因 底物浓度的降低、产物的增加造成的逆反应的加快 产物的抑制作用 酶本身逐渐失活,二.酶活力及其测定,1. 酶活力概念,常用的酶活力单位有三种：,A. 国际单位 (IU),这种单位是由国际酶学委员会规定的。,在标准条件(25、最适pH、最适底物浓度)下，酶每分钟催化 1 mmol 底物转化，这样的速度所代表的酶的活力即酶的量定义为1个国际单位 (IU)。,2. 酶活力与单位,二.酶活力及其测定,B. Katal,是由国际酶学委员会于1972年规定的一种新单位,在最适条件下，酶每秒钟催化1 mol 底物转化，这样的速度所代表的酶的活力即酶的量定义为 1个Kat 。,1 Kat = 60106 IU,2. 酶活力与单位,2. 酶活力与单位,二.酶活力及其测定,C. 自定义的活力单位,这种单位简单方便，省去了许多计算；但只能进行酶活力的相对比较。,酶习惯上或测定时使用的反应速度的单位定义为酶的活力单位。 有的甚至直接用测得的物理量，如单位时间内消光值的变化 (DA/t) 表示酶活力单位。,2. 酶活力与单位,2. 酶活力与单位,二.酶活力及其测定,指每毫克酶蛋白所含的酶活力单位数,比活力是酶制剂纯度的常用指标 比活力越大，表示酶越纯,3. 酶的比活力,二.酶活力及其测定,纯化倍数 = 每次比活力/第一次比活力,产率(回收率) = 每次总活力/第一次总活力100%,4. 酶的纯度,二.酶活力及其测定,1. 某酶在一定条件下，5 min内使30 mmol底物转变为产物，问该酶的活力（IU）是多少？,2. 从某细胞中提取的一种蛋白水解酶的粗提液300mL含有150mg蛋白质，总活力为360单位。经过一系列纯化以后得到的4mL酶制品(含有0.08mg蛋白)，总活力为288单位。请问回收率是多少？纯化了多少倍？,4. 酶的纯度,二.酶活力及其测定,不同样品同一酸制剂的总活力、总蛋白、比活力比较,4. 酶的纯度,二.酶活力及其测定,
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