蛋白质的化学修饰.ppt

蛋白质的化学修饰,12/1/2019,主 要 内 容,化学修饰的原理 蛋白质侧链的修饰 蛋白质肽链的交联 蛋白质的位点专一性修饰 化学修饰结果的解释 蛋白质化学修饰的应用 蛋白质化学修饰的局限性,12/1/2019,一、化学修饰的原理,概念：从广义上说，凡是通过化学基团的引入或除去，而使蛋白质共价结构发生改变，都可称为蛋白质的化学修饰。 有的情况下化学结构的改变并不影响蛋白质的生物学活性(称非必需部分的修饰); 但大多情况下将导致生物活性的改变(如下降以至完全丧失)。 影响蛋白质化学修饰反应进程的因素： 1.蛋白质功能基的反应性；2.修饰剂的反应性。,12/1/2019,1.1 蛋白质功能基反应性的影响因素,蛋白质的功能基所处的环境强烈地影响其理化性质，其分子的表面特征也影响化学试剂的接近。功能基的反应性是通过其亲核性来测量的，而亲核性又常常与其酸碱性(即pK值)有关。 1.1.1 微区的极性 决定基团解离状态的关键因素之一。从整体来看，局部极性的改变对氨基酸反应性影响： Tyr、Cys、-COOH -NH2、His Trp、Met和胱氨酸。,12/1/2019,1.1.2 氢键效应,天然蛋白质或其离子通过氢键维持其稳定性，也是使pK值发生改变的一个因素。 如水杨酸的-COOH可与酚基形成O-HO氢键，结果使其-COOH的pK值比正常值小1个pH单位，同时使酚基的正常pK10改变到pK13。因此在蛋白质的酚基-羧基相互作用中，羧基的pK值应比正常值低，而酚基的pK值高于正常值。,12/1/2019,1.1.3 静电效应,由于带电基团相互影响，导致同种氨基酸残基在不同的蛋白质中pK值存在差异。 如用高分辨率的NMR对His的电离行为研究表明：碳酸酐酶和葡萄球菌核酸酶各有4个His残基，其pK值是： 碳 酸 酐 酶：5.91；6.04；7.00；7.23 葡萄球菌核酸酶：5.37；5.71；5.74；6.50 His残基在这两个蛋白质中pK值几乎相差2个pH单位。,12/1/2019,1.1.4 空间障碍(位阻效应),处于蛋白质表面的功能基, 一般来说比较容易与修饰剂反应, 但如果烷基在空间上靠近功能基团, 会使修饰剂不能与功能基团接触, 出现位阻效应。 此外，其它因素也能改变蛋白质功能基反应性，如电荷转移、共价键形成、金属螯合、旋转自由度等。,12/1/2019,1.2 蛋白质功能基的超反应性,超反应性：指蛋白质的某个侧链基团与个别试剂能发生非常迅速的反应。 酶的催化活性基团通常对修饰剂是有反应的，但酶的超反应基团不一定是酶活性部位上的基团，可能与酶的功能或构象没有明显联系。,12/1/2019,1.2 蛋白质功能基的超反应性,影响因素： 1. 改变蛋白质功能基的pKa值； 2. 蛋白质功能基具有较大的亲核性； 3. 通过静电相互作用吸引试剂，并使其有适当的取向； 4. 试剂与靠近修饰部位的蛋白质区域之间的立体化学适应性； 5. 试剂的结合。,12/1/2019,1.3 修饰剂反应性的决定因素,1. 选择性吸附：化学修饰前，修饰剂根据各自的特点，选择性地吸附于低或高极性区的，有时可以根据对速度的饱和效应，检测出蛋白质 - 修饰剂复合物的形成，类似酶-底物复合物。 2. 静电相互作用：带电的修饰剂能选择性地吸引到蛋白质表面带相反电荷的部位。该作用可使修饰剂向多功能部位中的一个残基定位，或向双功能基一侧定位。此外，静电排斥力能抑制修饰作用。,12/1/2019,1.3 修饰剂反应性的决定因素,3. 位阻因素：蛋白质表面的位阻因素，或底物、辅因子、抑制剂所产生的位阻因素都能阻止修饰剂与功能基的正常反应。但修饰的结果却能提供蛋白质表面的有用信息。 4. 催化因素：修饰部位附近的其它功能基，若起一般的酸碱催化作用，也能影响修饰反应。 5. 局部环境的极性：许多有机反应的速度与溶剂的极性有关，而有些反应则与极性无关；疏水环境能阻止产物中电荷分离的反应。,12/1/2019,主 要 内 容,化学修饰的原理 蛋白质侧链的修饰 蛋白质肽链的交联 蛋白质的位点专一性修饰 化学修饰结果的解释 蛋白质化学修饰的应用 蛋白质化学修饰的局限性,12/1/2019,二、蛋白质侧链的修饰,蛋白质侧链的修饰主要是通过选择性的试剂或亲和标记试剂与蛋白质侧链上特定的功能基团发生化学反应而实现的。其重要作用是用于探测活性部位的结构。 理想情况下, 修饰试剂只是选择性地与某一特定的残基反应, 很少或几乎不引起蛋白质分子构象变化。 在20种常见AA残基中，仅具极性的侧链基团才能够进行化学修饰，这些基团的反应性取决于其亲核性。,12/1/2019,2.1 特定的AA残基侧链 基团的反应试剂,2.1.1 酰化及其相关反应 这类化学修饰试剂如乙酰咪唑、二异丙基磷酰氟(DFP)、酸酐磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯和O-甲基异脲等，在室温(20C25C)，pH 4.5 9.0的条件下可与蛋白质某些侧链基团如 -NH2、-OH、-SH及酚基等发生酰基化反应。,12/1/2019,2.1.2 烷基化反应,此类试剂 ( 如DNFB、碘代乙酸、碘代乙酰胺、苯甲酰卤代物、碘甲烷等 ) 常带有活泼的卤素原子，因其电负性而使烷基带部分正电荷，易于导致蛋白质分子的亲核基团 ( 如-NH2、-SH、 -COOH、 -SCH3和咪唑基 ) 发生烷基化。,12/1/2019,2.1.3 氧化和还原反应,H2O2、N-溴代琥珀酰亚胺等具有很强氧化性，能将侧链基团( -SH-SCH3吲哚基咪唑基和酚基)氧化, 往往易使肽链断裂(故要控制好氧化条件); 光敏剂存在下的光氧化是比较温和的氧化作用。 2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇(DTT)等主要用于-S-S-的还原剂。,连四硫酸钠或钾是一温和的氧化剂，常用于-SH的可逆保护剂。,12/1/2019,2.1.4 芳香环取代反应,蛋白质AA残基的酚羟基在3和5位上易于发生亲电取代的碘化和硝化反应。这类修饰反应的典型例子为四硝基甲烷(TNM), 可以作用于Tyr的酚羟基, 形成3-硝基Tyr衍生物。这种产物有特殊光谱，可用于直接的定量测定。,12/1/2019,另外，还有一些蛋白质与化学试剂的重要反应，如溴化氰(CNBr)裂解, 在自发和诱导重排的条件下主要导致Met残基的-COOH侧链肽键的断裂。,12/1/2019,2.2 巯基的化学修饰,巯基具有很强的亲核性，是蛋白质分子中最容易反应的侧链基团。常用的修饰剂有： 烷基化试剂特别是碘乙酸和碘乙酰胺是很重要的-SH修饰剂。修饰产物相当稳定，易于分析。此类试剂还能与MetLysHis反应。 N-乙基马来酰亚胺的修饰反应具较强的专一性，与SH形成对酸稳定的衍生物；并伴随光吸收的变化，易通过光吸收的变化确定反应的程度（max=300nm）。,12/1/2019,2.2 巯基的化学修饰,有机汞试剂是最早使用的-SH修饰剂之一，其中最常用的是对氯汞苯甲酸，它与-SH形成的衍生物在250nm处有最大吸收，可容许低浓度蛋白质的光谱定量分析。其中2-氯汞-4-硝基苯酚(MNP)与蛋白质分子中侧链-SH反应很快,并在395nm处产生1个负差吸收峰. -SH的氧化也是一种专一性很高的化学修饰手段. H2O2一般用于氧化-SH形成-S-S-或在较大量时形成磺酸，也可以生成次磺酸。,12/1/2019,2.2 巯基的化学修饰,5,5-二硫-2-硝基苯甲酸(DTNB), 又称Ellman试剂, 目前已成为最常用的巯基修饰剂。DTNB可与-SH形成-S-S-，使蛋白质分子标记一个TNB，同时释放1个有很强颜色的TNB2-， TNB2-在412nm具有很强的光吸收，通过光吸收的变化来监测反应的程度。 Ellman试剂常用于定量测定蛋白质分子-SH数目、研究-SH的改变程度和-SH所处的环境; 还用于探测蛋白质分子去折叠与再折叠的构象变化状态以及跟踪构象变化的过程。,12/1/2019,TNB2-,12/1/2019,2.3 氨基的化学修饰,氨基的修饰可分为三类：引入正电荷的修饰；电荷消失的修饰；引入负电荷的修饰。 Lys-NH2以非质子化形式存在时很活泼, 是蛋白质分子中亲核反应活性很高的基团，可被选择性修饰。,12/1/2019,2.3.1 引入正电荷的修饰,Lys修饰后侧链留下可电离的带正电的基团。 还原烷基化：醛与Lys侧链反应形成希夫碱，再用NaBH4还原希夫碱，得到稳定衍生物。,12/1/2019,2.3.2 电荷消失的修饰,这类试剂可抑制Lys-NH2的质子化, 使形成的衍生物不带电。 1. 乙酰化：在微碱性pH下，氨基与乙酸酐反应生成乙酰化衍生物。 2. 芳香化：TNBS与氨基作用, 生成的衍生物为黄色，可定量测定-NH2。 (其它:DNFBDNS),三硝基苯磺酸 (TNBS),12/1/2019,2.3.3 引入负电荷的修饰,1. 乙酰化: 此反应类似于乙酸酐与氨基反应, 但酸酐(如琥珀酸酐)所带负电荷全部引入到侧链上。 2. 烷基化：,12/1/2019,2.4 羧基的化学修饰,由于羧基在水溶液中的化学性质, 使得蛋白质分子中Glu和Asp的修饰很有限, 产物一般是酯类或酰胺类.,目前最常用的标准方法, 在比较温和的条件下就可进行,胃蛋白酶与14C硼氟化三甲洋盐在pH 5时酶完全失活,研究表明两-COOH为该酶必需基团,12/1/2019,2.5 咪唑基的化学修饰,His残基的咪唑基可通过N原子的烷基化或C原子的亲核取代来进行修饰。 1. 光氧化: 特异性低,除与His外, 还与Met、Trp以及少量Tyr、Ser和Thr残基进行反应。常用试剂有：碱性亚甲蓝、玫瑰红。 2. 焦碳酸二乙酯(DPC)是最常用的His残基的修饰试剂,在近中性时专一性较好, 使His残基的咪唑基上1个N羧乙基化, 并使得在240nm处的光吸收增加。在碱性条件下该取代反应是可逆的。,12/1/2019,12/1/2019,12/1/2019,2.6 酚与脂肪族羟基的化学修饰,Tyr残基酚羟基的修饰或芳香环上的取代修饰。 酚羟基的修饰一般是可逆的，一些甚至只能短暂的存在或在除去反应试剂后和纯化产品时可逆。简单的酯化反应是常用的方法，在弱碱性或羟胺溶液中就可重新生成酚羟基。 芳香环取代则可以生成比较稳定的产物，较早使用的是碘化作用。在温和的条件下，碘会与His和Cys残基发生反应；在剧烈条件下，Trp和Met残基也会受到影响。,12/1/2019,2.6 酚与脂肪族羟基的化学修饰,四硝基甲烷(TNM)因反应的高度专一性和反应条件比较温和, 已成为Tyr残基最常用的修饰试剂,它与Tyr残基发生反应生成离子化的发色基团-3-硝基Tyr衍生物。 Ser和Thr残基的专一性修饰研究的相对比较少它们的羟基一般都可被修饰酚羟基的修饰试剂所修饰，只是反应条件更严格些，而一旦反应，生成的产物比与酚羟基生成的产物稳定。典型的例子是Ser蛋白酶活性部位的Ser残基对酰化剂如DFP具有较高的反应性。,12/1/2019,12/1/2019,2.6 酚与脂肪族羟基的化学修饰,别构抑制剂AMP对酶活性有明显保护 作用,12/1/2019,2.7 胍基的化学修饰,Arg残基含1个强碱性的胍基，在结合带有阴离子底物的酶的活性部位中起重要作用。 因Arg残基的强碱性，因而与大多数试剂很难发生修饰反应，反应所需的高pH值也会导致蛋白质结构的破坏，而一些二羰基化合物则能在中性或弱碱性条件下与Arg反应。 常用的修饰试剂有：丁二酮(需在黑暗中进行, 因其可作为光敏剂破坏TrpHisTyr等残基)、1, 2-环己二酮和苯乙二醛.,12/1/2019,2.7 胍基的化学修饰,12/1/2019,2.7 胍基的化学修饰,12/1/2019,2.8 吲哚基的化学修饰,Trp吲哚基可以与一些试剂发生取代反应或被氧化裂解。因其反应性比一些亲核基团如-SH和-NH2差，且Trp一般位于蛋白质分子内部，故其不与通常使用的试剂反应。 N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)是常用的修饰试剂,它可使吲哚基氧化成羟吲哚衍生物, 反应可通过280nm处光吸收减少而进行监测；但Tyr有干扰。 Koshland试剂2-羟基-5-硝基苄溴(HNBB)可与Trp残基反应生成具有光吸收性的衍生物, 且对微环境的变化很敏感；但它也易与Cys-SH作用。,12/1/2019,2.8 吲哚基的化学修饰,水溶性差, 使修饰反应较难进行,410nm有光吸收,可测定修饰程度或Trp残基定量,12/1/2019,研究发现,在较高浓度NBS时,酶活性降低开始是因Cys的氧化,其后酶活性丧失与一个Trp残基氧化有关,12/1/2019,2.8 吲哚基的化学修饰,Na2S4O6保护-SH,12/1/2019,2.9 硫醚基的化学修饰,Met残基的化学修饰主要是由于硫醚的S原子的亲核性所引起的，但其极性较弱。 在温和的条件下，很难选择性地修饰Met残基，但几种氧化剂（如H2O2、光敏剂、过甲酸等）能使Met成为Met亚砜，甚至氧化成砜。因在AA分析中，亚砜在酸水解过程中常会生成Met，故很容易被忽略。 Met还可通过卤化烷基酰胺使Met烷基化。因S原子在一定强度的酸性溶液中(如pH2)处于非质子状态, 故Met可在pH4时被选择性烷基化。,12/1/2019,12/1/2019,2.9 硫醚基的化学修饰,在中性和弱碱性条件下, N-氯琥珀酰亚胺(NCS)和N-氯-p-甲苯磺酰胺(氯胺-T)可使蛋白质或肽段中Met氧化成Met亚砜。氯胺-T比NCS选择性好，因NCS与Trp发生作用；但二者都与Cys反应。 在Ca2+存在时用NCS修饰CaM, 发现其序列上71, 72, 76和109位Met被氧化, 同时失去与环核二苷酸磷酸二酯酶相互作用的能力, 说明Met在二者相互作用中起着重要作用.,12/1/2019,2.10 二硫键的化学修饰,同-SH类似, -S-S-具有其特有的特性, 可用来进行特异的修饰, 通常是通过还原的方法. 这些方法通常与某些-SH修饰方法结合,以阻止再氧化成-S-S-或计算断裂开的-S-S-数目。 常用的有: 巯基乙醇(具高度选择性和长的半衰期. 但要有变性剂, 且使用大大过量的巯基乙醇)、 Cleland 试剂包括二硫苏糖醇(DTT)及其差向异构体二硫赤藓糖醇(DTE) (勿需过量还原剂)。 -S-S-经还原成为-SH，一般情况下很容易自动氧化，故需经过羧甲基处理防止重新氧化。,12/1/2019,12/1/2019,-S-S-因其在蛋白质序列分析中及在蛋白质折叠研究中的重要地位，故-S-S-的化学修饰、数目测定以及位置确定尤为重要。 蛋白质分子有无-S-S-，以及是链内还是链间-S-S-，可通过非还原/还原(NR/R)双向SDS电泳确定. 无-S-S-的蛋白质分子位于对角线上(两个方向电泳迁移率相等); 含链间-S-S-的, 因-S-S-被还原断裂, 第二向电泳时由于分子变小而处于对角线下方;含链内-S-S-的, 因-S-S-被还原断裂, 分子伸展而体积增大, 故处于对角线上方。,12/1/2019,2.10 二硫键的化学修饰,12/1/2019,Laemmli O K. Nature, 1970, 227: 680-685.,两份同一样品分别经还原和非还原处理后，在同一胶上电泳。迁移率: NR=R, 则无-S-S-; NRR, 无链内-S-S-; NRR, 无链间-S-S-。,12/1/2019,主 要 内 容,化学修饰的原理 蛋白质侧链的修饰 蛋白质肽链的交联 蛋白质的位点专一性修饰 化学修饰结果的解释 蛋白质化学修饰的应用 蛋白质化学修饰的局限性,12/1/2019,三、蛋白质肽链的交联,双功能试剂：指具有两个反应活性部位，可在相隔较近的两个氨基酸残基间搭桥、形成多肽链内、链间或蛋白质分子间的交联，而不引起蛋白质构象的重大改变的试剂。 双功能试剂还可将一蛋白质分子偶联到一个化学惰性的水不溶性的生物大分子上，形成固定化蛋白质。 表征交联在一起的氨基酸残基或蛋白质, 可提供许多关于蛋白质构象和蛋白质间相互作用的信息。,12/1/2019,3.1 设计或选择交联剂要考虑的因素,反应的专一性 蛋白质分子上必须有能与试剂反应的适当基团, 且须在温和条件下反应,才能获得有关结构方面的信息。 现有的大多数交联剂通常能与蛋白质的-NH2或-SH反应。 提高交联反应专一性的方法很多, 常要小心控制pH。设计时要利用蛋白质上活泼反应基。,12/1/2019,3.1 设计或选择交联剂要考虑的因素,交联距离：随着交联剂两个功能基团之间距离跨度的增加, 形成交联的可能性也随之增加。 如跨度为1nm的交联剂, 可使蛋白质上1nm的功能基形成交联。一般交联距离为515 , 交联形成的化学键在一条直线上, 为一直链。链间交联时须使用最短的交联剂, 否则看不出肽链间交联。 注意：交联后所观察到的任何反应，应只是由于交联作用本身引起的，而不是由化学修饰作用引起的。,12/1/2019,3.1 设计或选择交联剂要考虑的因素,可裂解性: 在这类交联剂的两功能基之间, 含有交联后可在温和条件下被裂解的部分。利用这个特点, 结合双向电泳, 可很容易分离和表征交联的组分。 此外还可用于证明，生物活性的改变是由交联作用引起的(交联剂可裂解部分发生裂解后, 生物活性可恢复), 还是由单纯化学修饰引起的 ( 活性不能再生)。,12/1/2019,3.1 设计或选择交联剂要考虑的因素,反应活性部分: 可通过交联剂反应活性部分的疏水性、亲水性或电荷来控制反应部位； 也可将指向部位的不可逆抑制剂加入到异型双功能试剂的一端，使交联反应指向蛋白质上某一特殊结合部位。,12/1/2019,3.2 交联剂的类型,根据功能基团是否相同分为： 1.同型双功能试剂： 交联剂两端具有相同的反应活性部分。如双亚氨酯，可与氨基反应。两端间的间隔基团是(CH2)n, n=16, 跨度为0.51.1nm. 所有同型双功能试剂都对-NH2有专一性, 但戊二醛例外,它对-NH2和-OH作用, 反应机理不清. 2.异型双功能试剂: 一端与-NH2作用,另一端通常与-SH侧链作用.但碳二亚胺的第二反应基团是-COOH.,12/1/2019,12/1/2019,3.2 交联剂的类型,3. 可被光活化试剂: 此类试剂是异型双功能试剂的扩展, 其一端一般含有能与-NH2或-SH反应的基团, 而另一端则含有对光敏感的基团。也可作成具有不同跨度或具有可裂解性的试剂。用途广泛。 当交联剂一端反应基团与蛋白质作用后, 经光照, 另一端则产生一个反应活性部分, 这部分既可是碳烯(来自重氮试剂), 或氮烯(来自叠氮试剂)。二者为自由基, 有高反应性, 但没有专一性。,12/1/2019,3.2 交联剂的类型,根据交联剂可否被切断或裂解分: 可裂解交联剂: 将两条多肽链交联后,可以再经还原剂(如DTT)等将交联的有关化学键切断。 此类试剂有一个可切断的化学键如酰胺键、酯键或二硫键等。 此类试剂可用于寡聚酶蛋白质分子中相邻亚基之间的空间排列和聚合状态，寻找和分离多肽激素的受体，以及膜蛋白的研究。,12/1/2019,3.2 交联剂的类型,几种常用的可裂解的化学交联试剂,12/1/2019,3.2 交联剂的类型,不可裂解交联剂: 其与蛋白质交联后, 形成比较稳定的交联桥,可以增强酶蛋白与载体之间的稳定性, 在一般情况下是不可切断的。 典型的例子是戊二醛, 它具有两个反应活泼的醛基, 可与蛋白质分子中的Lys-NH2发生作用, 从而形成交联. 常被用于酶和蛋白质固定化。,12/1/2019,3.3 交联剂的应用,研究蛋白质的折叠: 当蛋白质浓度很大时, 交联剂也能形成分子间的交联键, 使蛋白质对变性趋于稳定。 如Rajput等用戊二醛将胰蛋白酶和胰糜蛋白酶交联在一起。这种固定化的杂化酶的优点是，显著地降低了杂化酶中胰蛋白酶的自溶作用，同时也使反应器的体积大大缩小。 酶分子内的交联常可提高酶分子构象的稳定性，防止酶失活。因此，设法增加酶分子表面交联键的数目是酶固定化的方法之一。,12/1/2019,3.3 交联剂的应用,测定蛋白质亚基的量: 如用辛二亚氨酸二甲酯作用于齐聚体蛋白质, 使在同一亚基内和多亚基间的Lys残基之间形成交联, 再进行SDS-PAGE, 则可测定其分子量和亚基的数目, 以阐明亚基的组合情况(如单体、二聚体还是三聚体等）。 用交联剂还能测定蛋白质上残基间的距离。如用跨度为0.371.45nm的一系列亚氨酯交联糖原磷酸化酶b, 再结合SDS-PAGE系统测定出, 在有效交联形成的四聚体上的两Lys残基间距离约为0.8nm。,12/1/2019,主 要 内 容,化学修饰的原理 蛋白质侧链的修饰 蛋白质肽链的交联 蛋白质的位点专一性修饰 化学修饰结果的解释 蛋白质化学修饰的应用 蛋白质化学修饰的局限性,12/1/2019,四、 蛋白质的位点专一性修饰,蛋白质化学修饰试剂的专一性包括： 1. 试剂对被修饰的基团的专一性：如DTNB只与蛋白质分子中的Cys-SH发生作用，而不与其它任何基团发生作用； 2. 试剂对蛋白质分子中被修饰部位的专一性：如修饰剂只作用于酶的活性部位，或酶蛋白上的激素结合部位(受体)等位点. 这类专一性化学修饰称为亲和标记或专一性的不可逆抑制作用.,12/1/2019,4.1 亲和标记,亲和标记是一类位点专一性的化学修饰, 试剂(抑制剂)可专一性地标记于酶的活性部位上, 使酶不可逆的失活。可分为两类: 1. Ks型不可逆抑制作用 这类抑制剂是根据底物的结构设计的,它具有和底物结构相似的结合基团, 同时还有一个活泼的反应基团, 能对活性部位侧链基团进行修饰反应, 使酶不可逆地失活。其反应分两步: A. 抑制剂与活性部位特异结合并发生反应; B. 将标记基团共价连接于活性部位上。,12/1/2019,4.1.1 Ks型不可逆抑制作用,这种修饰的特点: 底物、竞争性抑制剂或配体应对修饰有保护作用; 修饰反应是定量定点的修饰。,如：利用高碘酸氧化核苷酸标记蛋白质分子中嘌呤核苷酸结合部位。,12/1/2019,4.1.1 Ks型不可逆抑制作用,12/1/2019,4.1.2 Kcat型不可逆抑制作用,这类抑制剂是根据酶的催化过程设计的，设计或应用此类抑制剂，要求对酶的作用机制有一定的了解。 这类抑制剂具有和底物相似的被酶结合和被酶催化反应的性质，即它本身具有酶的底物性质。此外，它还具有一个潜伏的反应基团，在酶对它进行催化反应时, 此反应基团被酶催化反应而活化, 对酶的活性部位起不可逆抑制作用。 这类抑制剂专一性很高，又称“自杀性底物”。,12/1/2019,4.2 光亲和标记,光亲和标记是亲和标记中极为重要的一种。光亲和标记试剂除有一般亲和试剂的特点外，还有一个光反应基团。 光亲和标记的一般原理： A. 试剂先与蛋白质的活性部位在暗条件下发生特异性非共价结合，形成复合物； B. 在光照的情况下，试剂被激活后，产生一个高度活泼的功能基团，与活性部位的AA残基侧链基团发生反应，形成一个共价的标记物。,12/1/2019,4.2.1 光亲和标记原理,12/1/2019,4.2.2 光亲和标记试剂的特点,在黑暗中应是化学惰性物质，标记反应中所有的实验条件都不能破坏光亲和修饰反应的前体； 应易于合成，放射性标记的光亲和试剂的合成尤为重要； 在反应后基本不引起或很少导致蛋白质构象变化； 在某一光波下进行反应时，不应破坏其它生物分子体系如蛋白质、核酸。 反应的中间产物应是高活性的，即其半衰期很短； 高反应活性中间物能够和受体蛋白最终形成稳定的共价结合产物。,12/1/2019,4.2.3 光亲和标记的优越性,光亲和标记试剂在暗条件下呈化学惰性物质； 通过光照很容易控制其标记的程度、标记速度； 光反应产生的中间产物具有高度活性，可以标记在一般情况下反应活性很低的疏水残基和亲核氨基酸残基, 即蛋白质的所有氨基酸残基几乎都可以被标记。 光反应的高活性中间产物分为：A. 由共价单键均裂产生的自由基；B. 由双键均裂产生的卡宾（碳烯）和氮宾（氮烯）。,12/1/2019,主 要 内 容,化学修饰的原理 蛋白质侧链的修饰 蛋白质肽链的交联 蛋白质的位点专一性修饰 化学修饰结果的解释 蛋白质化学修饰的应用 蛋白质化学修饰的局限性,12/1/2019,五、化学修饰结果的解释,5.1 修饰反应专一性的控制 试剂的选择: 依据修饰的目的。 一般选择蛋白质修饰剂要考虑以下问题： 修饰程度； 对个别残基专一性； 修饰限度； 蛋白质的构象(基本不变); 修饰产物分离; 反应可逆性; 分析方法快速方便。,12/1/2019,5.1 修饰反应专一性的控制,用于酶活性部位氨基酸残基的修饰剂应具备以下特征： 反应应具选择性； 反应不应造成酶蛋白的变性； 修饰的残基在肽中稳定,易降解出来进行 鉴定； 反应程度能用简单技术测定。,12/1/2019,5.1 修饰反应专一性的控制,反应条件的选择: 允许修饰反应能顺利进行; 不造成蛋白质的不可逆变性; 有利于专一性修饰蛋白质。 因此, 应注意反应的温度、pH、反应介质和缓冲溶液的组成。,12/1/2019,5.1 修饰反应专一性的控制,反应的专一性: 控制反应条件; 利用蛋白质中某些基团的特殊性: 活性蛋白质的特殊的空间构象能影响某些基团的活性。如DFP的修饰胰糜蛋白酶中的活性Ser ,迅速导致酶失活。但在同样条件下却不能与胰糜蛋白酶原和一些简单的模拟化合物作用。 （“位置专一性”）,12/1/2019,5.1 修饰反应专一性的控制,选择不同的反应pH：蛋白质中各功能基的pKa是不同的, 控制不同反应的pH, 即控制了功能基的解离程度, 有利于修饰专一性。,12/1/2019,5.1 修饰反应专一性的控制,利用某些产物的不稳定性：在高pH下，用氰酸、CS2、O-甲基异硫脲和亚氨酸等，可将-NH2转变成脲和胍的衍生物；而与-SH形成的产物迅速分解。 亲和标记:如胰蛋白酶底物对甲苯磺酰-L-Lys甲酯(TLME)的抑制剂对甲苯磺酰-L-Lys氯甲酮(TLCK)。 差别标记：底物或抑制剂保护的活性部位基团被放射性同位素标记。 利用蛋白质状态的差异：有时在结晶状态下，可提高修饰的专一性。,12/1/2019,五、化学修饰结果的解释,在确证试剂已经作用于蛋白质的基础上，用物化方法验证修饰蛋白质在溶液中的构象是否发生显著变化外, 还应进一步证明修饰作用是否发生在活性部位上。,12/1/2019,五、化学修饰结果的解释,如果修饰发生在活性部位或必需基团上，则蛋白质活性的丧失与修饰程度一定成某种化学计量关系，且底物(或与活性部位结合的抑制剂)必然能降低修饰蛋白的失活程度, 而不与活性部位结合的分子则无此影响。 当采用可逆保护试剂时, 修饰失活的蛋白质随保护基的去除可重新恢复活力, 且活力恢复程度应与保护基去除量成一定比例关系。,12/1/2019,5.3 修饰残基的不稳定性,原始修饰后, 还可能发生共价改变。如: 酰基、巯基和卤素转移以及二硫交换过程可能自发地或在纯化、降解过程中发生。 蛋白质中的碘代酪氨酸相当不稳定，除对光和氧敏感外，在层析过程中，或在酸性介质中，有碘存在时，能发生脱碘化作用。 光氧化的组氨酸, 经酸水解后产生许多未知产物, 但这些未知产物峰的位置与正常氨基酸的峰位重叠。,12/1/2019,5.4 未发现的修饰,咪唑基、-SH2、-COOH甚至苯酚的酰化产物在反应条件下不稳定或在以后的纯化过程中被水解，因而检测不出。这种暂时性的修饰对构象的影响无疑会改变其它功能基的反应性和可接近性。 C端的-COOH能与一定强度的酰化剂作用，暂时形成混合酸酐, 结果使羧肽酶不能除去C端残基。 非末端-COOH也能产生环化亚酰胺或-天冬氨酸肽键。 在蛋白质化学中不占优势地位, 如汞盐常用于修饰-SH, 但它也能断裂-S-S-键。,12/1/2019,主 要 内 容,化学修饰的原理 蛋白质侧链的修饰 蛋白质肽链的交联 蛋白质的位点专一性修饰 化学修饰结果的解释 蛋白质化学修饰的应用 蛋白质化学修饰的局限性,12/1/2019,六、蛋白质化学修饰的应用,6.1 用于测定蛋白质分子中某种氨基酸的数量 研究蛋白质性质时，常需测定其中含有某种AA的数量。当然用AA分析法可得到此数据。但当只需知道某一AA的数量, 不需知道其它AA数量时, 则应建立仅对某一氨基酸的快速灵敏的分析方法, 实际上是用于蛋白质定量化学修饰。 常用且灵敏度高的方法是对氯汞苯甲酸与-SH作用; 三硝基苯磺酸与-NH2作用。用荧光法可测定微量蛋白质, 灵敏度高，常用荧光胺。,12/1/2019,6.2 在蛋白质序列分析中的应用,用于测定蛋白质及多肽化学结构的许多方法都是以蛋白质化学修饰为基础的。 A. 控制酶解程度: 如常用胰蛋白酶专一水解碱性氨基酸(Arg和Lys)的-COOH所形成的肽键。若要使胰蛋白酶只水解Arg所形成的肽键, 可用三氟乙酰化法将Lys-NH2保护起来, 使它转变为酶不能水解的产物。 B. 化学裂解: 最理想且普遍采用的是CNBr专一性裂解Met的-COOH所形成的肽键。,12/1/2019,6.3 在研究蛋白质高级结构中的应用,用化学修饰法可区别某些基团在蛋白质分子中的存在状态。一般认为能与试剂作用的天然蛋白质基团都处于分子表面。 化学修饰可用来测定蛋白质分子中特定基团之间的距离, 这可通过双功能试剂来实现。 用于研究蛋白质在溶液的构象。(侧链与环境); 可用于制备含重原子的蛋白质衍生物, 这对蛋白质晶体结构分析很有用。如测定HB晶体结构时, 将对氯汞苯甲酸引到蛋白质-SH上。,12/1/2019,6.4 确定蛋白质残基的功能,化学修饰结合保护实验可研究底物或其它配位体对修饰速度和程度影响。如用磷酸吡哆醛修饰Fru-6-P激酶时, 发现有两个Lys被修饰, 酶活力丧失; 而在Fru-2,6-PP存在时, 则可减弱修饰作用, 保护激酶活力。 若修饰的可逆性与生物功能的改变有对应关系,也可为确定某一残基的可能功能提供有利证据; 用于蛋白质变构部位上必需AA残基的分析, 以及协同作用所必需残基的表征。,12/1/2019,6.5 在蛋白质免疫化学研究中的应用,灵敏度很高的放射性免疫技术已广泛应用于蛋白质、多肽的检测和定量。其基础即为将放射性同位素碘引入到抗原分子的Tyr侧链上，产物保持原由的抗原性。抗体的酶标记也是同样的道理。 化学修饰还可消除医用酶的抗原性，提高其在体内的寿命。如Asn酶是治疗白血病的有效药物，但它的抗原性往往会在再度使用时引起免疫休克。用均三嗪活化的聚乙二醇修饰此酶，结果虽然酶活性丧失较多，但完全消除抗原性。,12/1/2019,6.6 蛋白质化学修饰在生物工程中的应用,提高酶的稳定性：酶的固定化技术 改变酶的专一性：黄素的溴酰衍生物可与木瓜蛋白酶的-Cys共价结合，结果将有水解活性的木瓜蛋白酶转变为具有氧化还原活性的黄素木瓜蛋白酶。 创造新的酶活性：许多重要的生物活性肽含D-AA，因肽酶只对L-AA有专一性，因此不可能在肽酶催化下合成含有D-AA的肽。 生产实践上的应用：医药(甲醛使细菌毒素和病毒改性)、毛纺(羊毛染色)、食品(去除杂味怪味)等。,12/1/2019,主 要 内 容,化学修饰的原理 蛋白质侧链的修饰 蛋白质肽链的交联 蛋白质的位点专一性修饰 化学修饰结果的解释 蛋白质化学修饰的应用 蛋白质化学修饰的局限性,12/1/2019,七、蛋白质化学修饰的局限性,蛋白质化学修饰只能在含有特殊功能基团的侧链上进行。 但蛋白质中有很多不含特殊功能基团的氨基酸，且从种属差异比较来看，它们在进化上又比较保守，X-射线衍射分析结果表明，这些AA侧链在维持蛋白质的特定空间构型方面起重要作用。目前的化学修饰方法不能用来研究这些氨基酸残基在蛋白质的结构与功能中的关系。,12/1/2019,七、蛋白质化学修饰的局限性,从整体来看，往往系统性不够。如蛋白质某一AA残基被修饰后，完全导致活性丧失，即其为蛋白质表现其生物学活性所“必需”的，但为什么必需就不能确切说明。 很少有对某一AA侧链绝对专一的化学修饰剂，同一修饰剂对不同蛋白的修饰行为不同，难以预测；化学修饰不改变蛋白质的构象是不可能的，而构象的变化又妨碍对修饰结果的解释。,