动物细胞培养技术PPT课件

第十二章：动物细胞培养技术,第一节 体外培养动物细胞的生物学特征第二节 动物细胞体外培养技术第三节 培养细胞常规检查和特性鉴定第四节 细胞同步化第五节 器官培养,动物细胞培养技术,动物细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织或器官取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养，并观察细胞的生长，发育及衰老等生命现象的技术。动物细胞培养有很多优越性，但也有不足之处。动物细胞培养已广泛应用于病毒学，免疫学，遗传学，肿瘤学，细胞生物学，毒理学和临床医学等各个领域。利用细胞培养技术已经生产出了多种生物制品，如狂犬病疫苗，干扰素，生长调节素。,第一节体外培养动物细胞的生物学特征,一、体外培养物的细胞生物学特点（一）生物学特征的两重性 1、基本生物学特征与体内细胞相似 体外培养的细胞不仅存在细胞和基质的相互关系， 而且细胞和细胞之间在形态和机能上还存在着相互关系 2、差异性 细胞离体后，失去神经和体液调节以及细胞间的相互影响，在体外培养条件下可能会出现分化现象减弱，形态功能单一化，生存一定时间后衰退死亡，出现连续生长的细胞系或恶性细胞系等。因此体外培养的细胞可视为一种在特定条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本机构和功能，也有不同于体内细胞的性状。,（二）培养细胞分化状态的改变,1、分化在个体发育的过程中，细胞后代的形态和功能上发生稳定性差异过程称为细胞分化。细胞经体外培养后，其原有的功能可能会迅速改变或消失，但其分化能力并未完全丧失。细胞是否分化，关键是在于是否存在使细胞分化的条件，把表皮细胞放在企业界面上培养，可分化成含大量角蛋白丝的胶质细胞，但这种能力会随着培养时间的延长逐渐丧失。2、去分化去分化也叫脱分化是指各种分化细胞，逐渐失去各自的形态与功能个性，表现出某种趋同性的过程。,二、体外培养细胞的形态,当细胞初一较好的培养条件时，形态上有相对的一致性。在一定程度上能反映细胞的起源以及正常和异常的区别，故可作为细胞形态学的一个指标或依据。但它可受很多因素的影响而发生改变。（一）贴附型细胞和悬浮型细胞1、贴附型细胞（见下图） 1） 成纤维细胞型 2 ）上皮细胞型 3 ）游走细胞型 4 ）多形细胞型2、悬浮性细胞,悬浮性细胞,（二）细胞帖壁过程,对于贴壁型细胞，在液体环境中生长时，基本呈圆形，当附于支持物表面后，开始仍为圆形，但很快会发生形态上的改变，转变为圆饼形即放射延展细胞。在1/2至2小时后，过渡为极性细胞，可呈纺锤形，三角形或不规则多角形等各种形态。支持物能影响贴附，底物表面不洁不利于贴附，底物表面带有阳性电荷利于贴附，一些特殊物质如LETS，细胞表面蛋白等也参与贴附过程。,（三）接触抑制和密度抑制,细胞在体外培养过程中，细胞数量不断增多，生长空间渐趋减少，最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后，如果培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制，导致细胞分裂停止。,三、培养细胞的增殖能力,体内细胞生长处于动态平衡环境中，而体外培养细胞的生存环境是培养瓶、培养皿或其他容器。生存空间和营养是有限的。当增殖到一定密度时，则需分离出一部分细胞并跟新营养液，否则将会影响细胞的继续生存，这一过程称传代（一）培养细胞生命期、 培养细胞生命期是指细胞在体外培养条件下持续增殖和生长的时间。正常细胞在体外培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生存全过程中，基本经历以下三个阶段。,1、原代培养基原代培养基也称初代培养基，即从动物机体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续一到四周。此期的细胞移动活跃，可见细胞活跃，可见细胞分裂，但不旺盛。原代培养的细胞于体内相应的细胞性状相似，更能代表其来源组织的细胞类型及组织特异性。2、传代期初代培养细胞一经传代后便改称为细胞系。此期最长，细胞增殖旺盛，能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质应在初代培养期或传代后早期冷冻。如不冷冻则要反复传代。一般，传代十至五十次左右，细胞增殖逐渐减慢，甚至停止，进入衰退期。3、衰退期衰退期的细胞虽然能存活，但增殖很慢并逐渐停止，进而发生衰退死亡,传代细胞由于目中因素的影响，可能发生自发转化，其标志是细胞获得永生性或恶性性。细胞永生性也称不死性，即细胞获得永久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体。转化细胞除了比正常细胞能分裂更多的代数之外，还具有不受细胞密度的影响，不具有接触抑制现象和细胞形状不规则，出现异常染色体的特性。转化后的细胞也可能具有恶性性质。（二）培养细胞“一代”生存期 体外培养的细胞当生长达到一定密度后，都需要做传代处理。 所谓细胞“一代”是指从细胞接种到分离在培养时的一段时间。它与细胞世代和倍增不同，在细胞一代中，细胞能倍增三至六次。每一代的细胞群体都会经历以下四个阶段：1、潜伏期 2、对数生长期 3、稳定期 4、衰亡期,1、潜伏期：细胞接种培养后，先经过一个在培养液中悬浮状态的悬浮期，此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于第五表面上的过程，称为贴壁，悬浮期结束。细胞贴附于支持物后，要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。细胞处于潜伏期可有运动行为，基本无增殖，少见分裂相。细胞潜伏期和细胞密度、细胞种类和培养基性质等密切相关。初代细胞培养细胞潜伏期长，24至96h或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅624h；细胞接种密度大时潜伏期短。2、对数生长期：当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入对数生长期。这是细胞增长最旺盛的阶段。对数生长期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数MI表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。MI=（分裂相个数/1000个细胞）100%3、稳定期细胞数量达饱和密度后，细胞逐渐停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平顶期。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养逐渐耗尽，代谢产物积累，ph降低。此时需做分离培养培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，甚至从底物脱落死亡，故传代应越早越好。4、衰亡期一个达到稳定生长期的细胞群体，由于生长环境的继续恶化和营养物质的短缺，群体中细胞死亡率则逐渐上升，以致细胞死亡数逐渐超过新生细胞数，群体中活细胞数下降。,（二）原代培养与传代培养,1、原代培养原代培养即第一次培养，是指将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程。由于原代细胞离体时间短，其原有的生物学特征仍然保持。一般在原代培养时期合适于作药物测试，细胞分化等方面的研究。（1）组织块培养法1）薄层培养法2）翻转干涸法,1、取材修剪冲洗2、剪切成1mm3 小块3、移入培养瓶4、分布组织小块间距5mm5翻转培养瓶并加培养液37*c静止12h6、翻正培养瓶进行培养7、原代细胞培养,（2）分散细胞培养法,1）机械分散法采用一些纤维成分很少的组织进行培养时，可以直接用分散法进行分散。可将组织直接用剪刀剪切，用吸管吸打，这种对组织损伤较大，一般可用注射器针心挤压通过不锈钢网的方法。2）消化分散法使用生物化学的方法将剪碎的组织块分散成细胞团或单细胞的方法。消化培养法可以将细胞间质包括基质、纤维等去除，是的细胞分散，形成悬液，适用于大量组织的分离。常用的消化液有胰蛋白酶，胶原酶。另外，链酶蛋白酶，黏蛋白酶，蜗牛酶等也可以用于细胞的分化。胶原酶是从细菌中提取的酶，对胶原和细胞间质有较强的消化作用，适用于分离纤维性组织，上皮组织和癌组织，Ga Mg 和血清成分不会影响胶原酶的消化作用，作用温和，无须机械振动。其常用量为200iu/ml,胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。,2、传代培养,当细胞持续生长增殖一段时间到达一定的细胞密度后，就应当将细胞分离到新的培养器皿并补充新的培养培养液进行培养，即为细胞的传代培养。在首次培养应注意以下几点：1细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面以前，不要急于传代，2原代培养时细胞多为混杂生长，上皮样细胞和成纤维样细胞并存的情况很多见，传代时不同的细胞有不同的传代时间，因而要根据需要注意观察并及时进行处理，3首次传代时细胞接种数量要多些，使细胞尽快适应新的环境而李宇细胞生存和增殖。贴壁细胞的传代大都采用酶消化法来进行。部分贴壁生长的细胞可用直接吹打或离心分离后传代。悬浮细胞可直接传代。,（1）贴壁细胞的消化法传代（2）悬浮细胞的传代,（三）细胞纯化,1、自然纯化自然纯化是利用某一细胞的增殖优势，而排挤其他细胞生长，最后留下生长优势细胞，去除其他细胞，达到细胞纯化的目的。2、人工纯化（1）酶消化法： 1）先用0，5%胰蛋白酶和0，02%EDTA（1：1）混合液漂洗培养细胞，然后再换新的混合液继续消化，之后在导致的显微镜下观察并不时摇动培养瓶，等到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化。 2）吧消化液吸入离心管中，离心去上清，然后移入另一培养瓶中，加培养液置温箱中培养，再向原瓶中也不加新的培养液继续培养。经过几次反复处理，可把成纤维细胞除净。（2）机械刮除法 1)标记 镜下观察，在培养皿背面圈下上皮细胞生长部位 2)刮除 弃培养基，把无菌刀深入瓶中，肉眼或显微镜下刮除无标记空间 3)冲洗 用hanks液冲洗1或2次，洗出被挂掉的细胞 4）培养 然后注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞存留，可重刮除（3）反复贴壁法 操作方法与贴壁细胞传代基本相同（4）克隆法（5）流式细胞仪技术（6）其他纯化方法,（四）细胞的冻存复苏及运输,1、细胞冷冻保存（1）细胞超低温保存的原理细胞在-70*c以下时，细胞内的酶活性降低，代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。细胞低温保存的关键在于通过-200*c阶段的处理过程。在此温度范围内，易造成细胞的严重损伤。如果不加保护直接冷冻，细胞内水分结晶，导致胞内电解质浓度增高，ph改变，部分蛋白质变性，溶酶体膜受损而导致溶解酶释放破坏细胞结构，从而造成细胞死亡。因此，为了减少细胞内的冰晶形成，一般在培养液中加入保护剂以减少冰晶形成和细胞死亡。根据冷冻保护剂是否透过细胞膜可将其分为：1渗透性保护剂2非渗透性保护剂最常用的保护剂为dmso本身对细菌有毒性作用，可自身灭菌。（2）细胞冷冻过程将对数期细胞以等体积20%DMSO培养液重悬，并分装于冷冻管或安培平中，封口，然后降温至4*c30min，冰盒10min，液氮罐气相2h，最后投入液氮中保存。2、冻存细胞的复苏（1）离心法1）取出冷冻管，迅速投入3740*c水浴中，振荡，使之融化。2）吸入到10ml的培养液中，混悬，离心洗涤1或2次3）取上清加培养液，调浓度为1*1052*105个/ml（2）直接铺板法取贮存细胞，37*c水浴中快速融化，移入完全生长培养集中，进行活细胞计数，密度3*105个/ml 培养1224小时，更换新鲜的完全生长培养基，以去除冷冻剂。,3.细胞运输1冷冻储存运输2充液法1）选生长良好的细胞，待接近或刚连接成片时去掉培养液，充新培养液，液量达到瓶颈部，拧紧螺帽，保留微量空气；2）妥善包转运送，瓶口用胶带密封，并用棉花等做防震防压处理。3）到目的地后，倒出大部分培养液，仅保留维持细胞生长所需液量，置于37*c培养，次日传代,二、动物细胞培养的基本方法,（一）悬滴培养法（二）培养瓶培养法（三）培养板培养法（四）旋转管 培养法（五）灌注小室培养法（六）克隆培养法,六、单细胞分离培养技术主要分为三种，即多孔塑料板克隆细胞法、琼脂培养法和饲养细胞层克隆法,1、多孔塑料板克隆细胞法首先将细胞悬液混合均匀，在每孔内加入，0，1ml的细胞悬液。加完后迅速盖好盖板，镜检，记录含有单个细胞的孔。观察时要特别注意孔底边缘，凡不能确认者不要计算在内，用笔标记。然后于co2培养箱进行原代和传代培养。等到培养板孔内细胞增至500600个时，可以进行分离培养。2、琼脂培养当琼脂凝固时，可以把细胞接种在琼脂表面，生长成克隆后，容易分离，适于做单细胞克隆。此外，也可以用营养液配成软琼脂，在溶解状态下把细胞与之混合起来，细胞在松软的琼脂中摄取营养和生长，软琼脂培养是测定克隆形成率及测试转化细胞形状的重要手段。3、饲养细胞层克隆法此法是将饲养细胞接种在培养皿中，培养两天后，即可接种准备克隆的细胞。饲养细胞也称为滋养细胞，是一层经过特殊处理的用做克隆底物的细胞层,三、动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术是指在人工条件下，在细胞生物反应器中高密度大量培养动物细胞的方法。（一）动物细胞大规模培养方法动物细胞与微生物细胞相比有显著差别：1）动物细胞比微生物细胞大的多，无细胞壁，耐机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差2）倍增时间长，生长缓慢，易受微生物感染，培养时需要抗生素3）培养过程需氧量少4）培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在5）原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡 6）代谢产物具有生物活性， 生产成本高，但附加值也高1、转瓶培养2、反应器贴壁培养3、悬浮培养4、固定化培养 是将动物细胞与非水溶性载体结合起来，在生物反应器中进行大规模培养的方法。,固定化培养（1）微载体系统1)微载体法2）多空载体或大孔微载体法其优点：1比表面积大，是实心微载体的几 倍甚至几十倍2细胞在孔内生长，受到保护，剪切损伤少3细胞三维生长，细胞密度是实心微载体的十倍以上，有的可达108个/ml 4适用于长期维持培养5实心载体在培养液中浓度怎大到一定时，细胞密度反而下降，大孔微载体在浓度较高时，表面碰撞增加，能促使细胞在孔内生长6最适合与蛋白质生产，因此有人预言，大孔微载体技术将成为动物细胞大规模培养的一种常用方式。（2）中空纤维培养技术(3)微囊培养系统,（二）动物细胞大规模培养用生物反应器种类,1、搅拌式生物反应器 1）供养方式 一般情况下，搅拌式反应器常伴有鼓泡，为细胞生长提供所需养分。因动物细胞对鼓泡敏感，所以对供养方式进行改进，生产了笼式供养方式的动物细胞反应器。特点是既能保证混合效果又有竟可能小的剪切力，以满足细胞生长的要求。 2）搅拌器 改进中，再搅拌器较薄而面积较大，或搅拌角较大而搅拌速度较低的情况下，可显著降低剪切力。2、气升式生物反应器 其是以气体为动力，靠导流装置引导，形成气液混合式的总体有序循环。3、填充床反应器填充床反应器中，细胞可以位于支持物表面，也可以包埋于支持物之中，培养物流经支持物颗粒。细胞被固定于支持物之中时，填充床反应器每单位体积能容纳大量细胞。但是，填充床式固定化细胞反应器存在许多缺点。由于其混合效果低，对必要的氧传递,ph,温度控制和气体产物的排除造成了困难。4、流化床反应器 其是通过流体的上升运动使固体颗粒维持在悬浮状态即流化状态进行反应的装置。有鱼固体颗粒和流体充分地进行混合，因而流化床反应器具有传热传质性能好，可使用较小颗粒催化剂，床层压力小等特点。但同时也带来固体催化剂磨损较大的不足。,（三）大规模培养操作方式,可分为分批式，流加式，半连续式，连续式和灌流式。其中，分批式，半连续式，连续式和植物细胞培养基本相同。1、分批式培养分批式培养是将细胞和培养基一次性装入反应器内进行培养。反应器系统属于封闭式，培养过程中和外界没有物料交换。其体积不变，到细胞增长和产物形成积累到一定时间，一次性收获细胞和产物。周期一般在三到五天，收获产物一般是在细胞快要死亡或已经死亡后进行。2、流加式培养是指先将一定量的培养液装入反应器，在适宜环境下接种细胞，进行培养。培养过程中，根据细胞对营养物质的消耗和需求，流加浓缩的营养物或培养基，流加速度和消耗的速率相同按底物浓度控制相应的流加过程，从而使细胞持续生长至较高的浓度，目标产物达到较高的水平。通常流加多在指数生长后期，细胞在进入衰退期之前，添加高浓度的营养物质。在细胞衰亡后终止整个体系，进行分离细胞和细胞碎片，浓缩，纯化产物。其特点是能调节培养环境中营养物的浓度。一，可以避免因某种营养成分初始浓度太高而产生抑制现象。二，能防止某些限制性成分在培养过程中被耗尽而影响而影响细胞的生长和产物的生成，这是流加式操作和分批式操作的明显不同。此外，由于新鲜营养液的加入，整个过程中反应体积变化，这也是其重要特征。,3、半连续式培养、其特点是培养过程中培养物的体积逐渐增加，反应器内培养液的总体积保持不变；细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间；可进行多次回收。4、连续式培养是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。该模式事将细胞接种于一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达到最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续田间新鲜培养基。同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可以无限连续下去。其优点是反应器的培养状态可以达到恒定，细胞在稳定状态下生长。细胞浓度以及细胞的生长速率可维持不变。5、灌流式培养是把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断将部分条件培养基取出，同时又连续不断地灌注新的培养基。它与半连续式培养的不同之处在于取出部分条件培养基时，绝大部分细胞均保留在反应器内，而半连续培养在取培养物的同时也取出了部分细胞。灌流式培养的优点：细胞截流系统可使细胞保留在反应器内，维持较高的细胞密度，一般可达107109个/mL，从而较大的提高了产品的产量。连续灌流系统，使细胞稳定的处在较好的营养环境中，有害代谢废物浓度积累较低；反应速率容易控制，培养周期较长，可提高生产率，目标产品回收率高；产品在罐内停留时间短，可及时回收到低温下保存，有利于保持产品的活性。这种方法最大困难是污染概率较高，且存在长期培养中保持细胞分泌产品的稳定性以及规模放大过程中的工程问题。,（四）动物细胞工程表达产品应用,20世纪60年代初，英国AVRI研究所在贴壁细胞系BHK21中将口蹄疫病毒培养成功后，动物培养技术在规模和可靠性方面都不断发展，生产各种蛋白质药物和疫苗越来越受人们的重视并在疾病防御方面也得到了应用。1、疫苗是用大规模细胞培养方法生产的主要产品之一。美国公司应用SV40作为载体，将乙型肝炎表面抗原基因插入哺乳动物细胞内，已获得高效表达，并制成乙型肝炎疫苗。目前，已实现商业化产品有：口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰质炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、疱疹病毒疫苗和巨细胞病毒疫苗等。这些疫苗已被大规模应用。2、单克隆抗体应用大规模细胞培养系统生产各种不同的单克隆抗体是经济可靠地方法。英国的Celltech公司采用100L和1000L自动气升式培养系统，培养各种生产单克隆抗体的小鼠、大鼠和人的细胞株，生产各种单克隆抗体的产品，已应用于疾病诊断、治疗和免疫学研究。,3、基因重组产品动物细胞能精确地转译和加工较大或更复杂的蛋白质。此外动物细胞还可以把人们所需的蛋白质分泌到培养液内，而从培养液分离蛋白质要比细胞匀浆更容易。因此，利用动物细胞培养方式可大量生产基因重组产品。如美国的En -dotronic公司用Acusyst-P型中空纤维培养系统生产出了免疫球蛋白G、A和M，尿激酶，人生长激素，乙型肝炎表面抗原等产品。目前，国内外采用动物细胞生产的药物主要有重组人粒细胞集落刺激因子、a-2a干扰素、a-2b干扰素、y-干扰素、人白细胞介素-2、重组人红细胞生成素、表皮生长因子和重组牛碱性成纤维细胞生长因子等。,第三节培养细胞常规检查和特性鉴定,一、培养细胞的生物学鉴定和细胞系（株）的建立 由于体内和体外环境不同，培养细胞的生物学特性与体内细胞有所不同。在培养细胞期间，要对细胞进行常规性检测，包括细胞形态、细胞生长状况、营养液和微生物污染等方面。一旦细胞生长成形态上单一的细胞群或细系后，还要做一系列的细胞生物学方面的检测。（一）、细胞形态观察 细胞形态的观察内容主要包括细胞的形态、核质比例、染色质、核仁大小和多少以及微丝微管的排列状态等。一般生长状态良好的细胞，在相差显微镜下观察，轮廓清晰，如细胞生长条件改变或细胞功能不良时，胞质中常出现空泡、脂滴和其他颗粒状物，细胞之间空隙加大，细胞形态可以变得不规则，如上皮细胞变成纤维类细胞。（二）、细胞生长情况1、细胞生长曲线的测定 细胞生长曲线是观察细胞生长规律的重要方法。因而，在细胞的生长特性观察中，生长曲线的测定是最为基本的指标。标准的细胞生长曲线近似“S”形。一般在传代后第一天细胞数有所减少，在经过几天的潜伏适应期，进入对数生长期，达到平台期后生长稳定，最后衰老。 在生长曲线上细胞数量增加一倍的时间，称为细胞倍增时间，可以从曲线上换算出。细胞倍增的时间区间即细胞对数生长期。细胞传代、实验等都应在此区间进行。细胞群体倍增时间的计算方法有两种，一为通过作图方法在细胞生长曲线的对数生长期找出细胞增长一倍所需的时间，即倍增时间；二为通过公式按细胞倍增时间计算细胞群体倍增时间。常用细胞生长曲线的测定方法有：,（1）细胞计数法 1） 将细胞利用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液。经计数后，精确地将细胞分别接种于2130个大小一致的培养瓶中。每瓶细胞总数要求一致，加入培养液的量也要一致。细胞接种数不能过多，也不能太少，太少细胞适应期太长；数量太多细胞将很快进入增殖稳定期，需要在短期内进行传代，生长曲线不能确切反应细胞生长情况。一般接种数量以710天能长满而不发生生长抑制为度。同种细胞的生长曲线先后测定要采用同一接种密度，这样才能做纵向比较。不同细胞也要接种细胞数相同，才能进行比较。2)每天或隔天取出3瓶细胞进行计数，计算均值。一般每隔24h取1瓶，连续观察一至二周或到细胞总数有 明显减少为止。培养三到五天后常要给未计数的细胞换液。3）以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，连接成曲线后即成该细胞的生长曲线。（2）四唑盐比色实验四唑盐是一种能接受氢原子的燃料，简称MTT。基本原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反应其细胞数量。在一定细胞数量范围内，MTT结晶物形成的量和细胞数成正比。它的特点是灵敏度高，重复性好，操作简便，无放射性污染。（3）CCK-8试剂盒检测法其基本原理是，该试剂中含有WST-8，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲赞产物。生成的数量和活细胞的数量成正比，细胞增殖越多，则颜色越深。CCK-8与MTT的不同之处在于CCK-8法生成的formazan是水溶性的，不需要再吸出培养液加入有机溶剂溶解这一步，因此可以减少误差。优点是重复性和灵敏度优于MTT，对细胞毒性小。,2、细胞分裂指数,分裂指数是指细胞群体中分裂细胞所占的百分比，即细胞群的分裂相数/1000个细胞。获得细胞相数值后，可以绘制成细胞分裂指数曲线。一般细胞分裂指数曲线与生长曲线趋势一致，但细胞增长进入停滞期后，细胞数值增大，而分裂相完全消失。,3、细胞接种存活率细胞接种存活率=（贴壁存活细胞数/接种细胞数）x100%4、细胞周期（1）放射性核素标记自显影法在细胞进入增殖期后，可以用川标记的胸腺嘧啶核苷处理30min后，每隔30min取材，直到48h为止。观察和计算细胞分裂相出现的时间、高峰和消失分裂相数，绘制成图进行分析。（2）流式细胞仪测定法选择对数生长期细胞，用消化法制成细胞悬液，使细胞成为单个细胞，不能成团。然后根据流式细胞仪的检测步骤进行操作。最后通过计算机分析结果计算出细胞周期。,5、细胞活力的检测细胞损伤或死亡时，某些燃料可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合而着色。而活细胞能阻止这类染料进入细胞内。借此可以鉴别死细胞与活细胞。1）台盼蓝排斥实验 死细胞被染成淡蓝色，而活细胞据染，从而达到区别培养细胞活力的目的。2）伊红Y排斥实验 本法与台盼蓝排斥实验类似，但用伊红Y染色后，活细胞与死细胞的对比度不如台盼蓝排斥实验。3）苯胺黑排斥实验 死细胞被染成黑色，活细胞不被染色。,（三）培养细胞种属鉴定的方法1、荧光抗体染色鉴别细胞的种属利用间接荧光抗体染色技术对细胞系的种系进行鉴定。步骤是用兔身上产生的特异性抗血清标记待检测阳性对照细胞和阴性对照细胞，然后加标记有荧光染料异硫氰酸荧光素的山羊抗兔免疫球蛋白抗体，加上的荧光抗体将结合到已标记有兔抗体的靶细胞上，借助荧光即可看到抗原-抗体复合物。2同工酶谱系鉴别细胞种属通过确定6-磷酸葡萄糖脱氢酸，乳酸脱氢酶和核苷酸酸化酶的淀粉胶电泳的迁移率，鉴定细胞系的种属。该法有高度的可靠性，G6PD、LDH、NP的电泳迁移率差异不仅可用来鉴别细胞系种属，还可查出种内细胞的交叉污染。根据同种异体同工酶的表型和正常人群体的表型频率资料，可以估计出一特定细胞系遗传特征出现的频率。3、染色体分析用显微镜观察细胞核型特点，进行染色体核型分析。包括检测染色体数量，标记染色体的有无，带型等。亲缘关系近的灵长类细胞系之间和人癌细胞之间的比较可用Giemsa现代分析4、人主要组织相容性抗原人主要组织相容性抗原又称人类白细胞抗原，存在于大多数有核细胞膜上，常用的抗原检测是用补体依赖细胞毒实验，用拒染来鉴定细胞活性。个别情况需要改动，主要的变化原因是HLA血清中的非特异性抗体的出现。细胞系上存在特定的HLA同种异体抗原，细胞吸收抗血清中已知特性的HLA同种异体抗体，由吸收后细胞毒效应减少量而得知细胞表面HLA抗原的情况。5、核酸技术用重组DNA技术或DNA探针技术鉴定和定量培养细胞中等位基因的多效性。,四、细胞系（株）的建立,1、建立细胞系的要求1）组织来源应说明细胞供体所属物种是来自人体，动物或其他；供体的年龄，性别，取材的器官或组织。2）细胞生物学检测应了解细的一般和特殊的生物学特性，特异性；看其是否有特殊产物包括分泌蛋白或激素等。3）培养条件和方法各种细胞都有自己比较适应的生存环境。因此，应指明使用的培养基，血清种类，用量以及细胞生存的适宜ph等。2、培养细胞的命名HeLa：为供体患者的姓名(来源于宫颈癌)CHO:中国地鼠卵巢细胞(chinese hamster ovary)宫-743：宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立NIH3T3:美国国立卫生研究所建立每3天传代，每次接种3x105个/ml3、已建立细胞系的鉴定、管理和使用按国际惯例，当一个细胞系或细胞株建立后，研究者需要认真负责地把有关资料在杂志或期刊上报道，详细介绍上述个项目即可。建立细胞系后，还要对细胞系进行维持：记录好细胞系档案；注意保持其规律性；细胞系传代要防止交叉污染；每一种细胞系有冻存储备。,二、培养细胞的常规检查,（一）培养液和ph检查培养液一般情况下是呈桃红色，但随着时间的延长，由于CO2积累过多，培养液会发生酸化变黄，如果不及时调整ph，会对细胞发生不利的影响，严重时细胞脱落发生死亡。（二）细胞生长情况分析在很多情况，最先从组织又走出的为游走细胞，他们单独活动，形态不规则，用缩时逐格显微电泳法可以揭示出它们活跃的变形，游走和吞噬活动。游走细胞之后，接着出现的是成纤维细胞或上皮细胞，此时的细胞很少分裂。只有当细胞分裂出现以后，细胞数量逐渐增多，形成较大的生长晕或连接成片时，进入生长状态。上皮细胞在生长过程中还常产生溶解酶，使得细胞发生液化，导致细胞相互分离，形成所谓的拉网现象，可能导致细胞脱落。,（三）培养细胞的污染检测和排除,1、污染途径1)空气 空气是微生物及尘埃颗粒传播的主要途径。应将培养设施设在避风场所，做到无菌操作。2）器材 各种培养器皿、器械消毒不彻底和洗刷不干净可导致污染，另外co2培养箱等如果不定期消毒，可能引起污染。3）操作 实验无菌操作意识不强，技术不熟练，使用污染的器皿或封瓶不严等，都可造成污染。培养两种以上细胞是，操作不规范，交叉使用吸管和培养液，培养瓶等有可能导致细胞交叉污染。4）血清 有些血清在生产时就已经被支原体或病毒等污染，变成了污染源。5）组织样本 原代培养的污染多数来源于组织样本，取材时碘酒消毒后脱碘不彻底，可造成碘混入组织，细胞或培养液中，影响细胞生长。,2、污染对培养细胞的影响及污染的检测1）细菌污染 常见的细菌污染有大肠杆菌，假单胞菌和葡萄球菌。细菌污染初期由于培养体系的抗生素作用，其繁殖处于抑制状态，细胞生长不受明显限制，污染情况用倒置显微镜观察不易判断。怀疑培养细胞有污染时，取10ml细胞悬液，100r/min离心5min，沉淀中加入无抗生素培养液2ml，将细胞放培养箱培养，24小时内可以获得阳性结果。当污染的细菌量比较大或细菌增殖到一定基数，增殖的细菌就可以导致培养液外观浑浊。肉眼就可以判断。2)真菌污染一般真菌污染易发现，有白色或黄色污染物。在倒置显微镜下可以看见在细胞之间有纵横交错穿行的丝状，管状或树枝状菌丝，并悬浮飘荡在培养液中。念珠菌或酵母菌形态成卵形，散在细胞周边和细胞之间生长。有时通过显微镜观察可能发现瓶底外面生长的菌丝，不要错当是培养瓶内的污染。瓶外的污染物应及时用酒精棉球擦洗。3）支原体污染支原体是一种简单的细胞。细胞被支原体污染后，支原体可与细胞长期共存，一般不会死亡，培养基一般不会发生浑浊。多数情况下，细微变化可以经过传代换液而缓解，外观给人以正常感觉，实则细胞受到多方面潜在影响。个别严重者，可以导致细胞增殖缓慢，甚至从培养瓶脱落。可以利用相差油镜观察有无支原体污染。支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间。利用荧光染色法可使得支原体内含有的dna着色进行观察，也可利用扫描电镜和透射电镜观察支原体。目前，有专门做支原体检测的试剂盒，可以帮助尽快发现支原体的污染。另外，市场上有新一代支原体抗生素M-Plasmocin，能有效地杀灭支原体，又不影响细胞本身代谢。,3、污染的预防1）器皿严格消毒 2）操作间的消毒 定期清洗或更换超净台的空气滤网，请专职人员进行定期检查超净台的空气净化标准。检查培养皿有无消毒标志。新配制的培养基应确定无菌的情况下方可使用，操作之前先用紫外灯灭菌半小时。3）操作过程中预防操作应戴口罩，双手消毒。操作过程中应避免手碰到无菌部位。在开培养瓶盖时妖精酒精灯烧灼。用培养液时要用专门的吸管。使用培养液时不宜过早开口。开瓶后的培养瓶应保持斜位，避免直立。不用了的培养液应立即封口。培养细胞处理前不要过早暴露。操作时避免交谈，打喷嚏和咳嗽。操作完毕及时打扫超净台。4）其他 应及早冻存培养物。重要的细胞株应有两个人独立完成。购入的未灭活血清应采取56*c水浴灭活30min，使血清的补体和支原体灭活。为了避免诱导抗药细菌，应定期更换培养系统的抗生素，或尽可能不用抗生素。对新购入的细胞株应加强观察，防止外来的污染源；定期消毒培养箱。,4、污染的排除通常用高压灭菌法处理被污染的细胞，然后丢掉。如果有价值的细胞被污染，并且污染程度较轻，可以通过及时排除污染物，挽救细胞恢复正常。常用排除微生物污染的方法有以下几种：1)抗生素培养法 各种抗生素性质不同，对微生物作用也不同，联合应用比单用效果好，预防性运用比污染后运用效果好。有的抗生素对细菌仅有抑制作用，无杀灭效应。反复使用抗生素还能使微生物产生耐药性，而且对细胞本身也有一定的影响。一些有价值的细胞被污染后，加入高浓度抗生素作用24至48H，再换入常规的培养液。2）加温除菌 根据支原体对热敏度的特点，将受支原体污染的细胞加温处理（41*C，510h）可以杀灭支原体。3）动物体内接种 将受微生物污染的肿瘤细胞接种到同种动物皮下或腹腔，借动物体内免疫系统消灭微生物，待肿瘤细胞在体内生长一定时间后。从体内取出再进行体外培养。4）与巨噬细胞共培养 巨噬细胞在体外条件下仍然能吞噬微生物并将其消化。 另外，巨噬细胞可分泌一些细胞因子支持其他细胞的克隆生长。因此，采用96孔板将极少培养细胞与巨噬细胞共培养，可以在高度稀释培养细胞，极大地降低微生物污染程度的同时，更有效的发挥巨噬细胞清除污染的效能。,第四节、细胞同步化,细胞同步化是指为研究细胞周期的不同阶段的生化特征，必须获得与细胞周期一致性的细胞。细胞同步化分自然同步化和人工同步化。一、选择同步化（一）有丝分裂选择法这种方法主要是根据细胞周期的不同阶段的生理变化设计的。是单层培养的细胞处于对数增殖期，此时细胞分裂活跃，分裂指数高，有丝分裂的细胞变圆隆起，与培养皿的附着性低。此时轻轻震荡，M期细胞脱离器壁，悬浮于培养液中，手机培养液，再加入新鲜培养液，依此法继续收集，则可以获得一定数量的中期细胞。此法不足之处是只能在铁臂细胞中用。（二）细胞沉降分离法此法主要用于悬浮细胞。不同时期的细胞体积不同，而细胞在给定离心场中沉降的速度与其半径的平方成正比。因此，可用离心的方法分离细胞。,二、诱导同步化,（一）DNA合成阻断法选用DNA合成的抑制剂，可逆的抑制DNA合成，将细胞群阻断在S期或G/S交界处。胸腺嘧啶核苷双阻断法：该法利用过量的TdR能阻碍DNA合成的原理而设计，为了加强细胞同步化效果，常采用两次TdR阻断法，即双阻断法。第一次阻断时间相当于G2 ，M和G1的总和或稍长。释放时间不短于S其时间，而小于G2+M+G1期时间，这样才能是所有位于G1/S期的细胞通过S期，而又不使沿周期前进最快的细胞进入下一个S期。第二次阻断时间同第一次，再释放。（二）中期阻断法秋水仙素结合的微管蛋白可加合到微管上，但阻止其他微管蛋白单体继续添加，从而破坏纺锤体结构，导致染色体不能分开，将细胞阻断在中期。常用的药物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性较小。秋水仙酰胺阻抑法操作如下：1）将细胞传代培养至指数生长期2）加入秋水仙酰胺，是最终浓度为0.050.1ug/ml培养基，作用67h。如使用秋水仙素，使用浓度应加大510倍3）震荡收集细胞，8004r/min离心510min，弃上清，收集的沉淀细胞即为M期细胞。加入一定量培养基将细胞接种到培养瓶中。由于秋水仙素和秋水仙酰胺都对细胞有一定毒性，用量较小或作用时间较短细胞活性尚可恢复，而用量过大或时间过长则细胞不能存活。因此，使用时应严格控制其剂量和作用时间。,三、各期细胞的获得（一）G2期细胞的获得根据细胞周期测定的数值，采用TdR双阻断法使细胞同步在G1/S期交界处后，洗去TdR使细胞释放后继续培养。其培养时间应大于S期时间而小于S+G2期时间。然后先用振荡法使已进入M期的细胞脱落，弃去上清培养基；再用胰蛋白酶消化，加入新鲜培养基制成细胞悬液，离心收集细胞即为G2期细胞。（二）G1期细胞的获得1）将用M期阻断法获得的细胞加入一定量的培养基，继续培养1至10h即可获得各阶段的G1期细胞。2）用缺乏异亮氨酸的培养基培养细胞，培养时间超过一个细胞周期，即可获得G1期细胞(三）G0期细胞的获得可采用血清饥饿法得到G0期细胞1）取处于对数生长期的细胞2）用含0.5%1%小牛血清的培养基培养细胞4872h，或用无血清的培养基培养24h3）用0.10.25%胰蛋白酶消化细胞可收获G0期细胞，可用3H-TdR掺入惊醒测量鉴定。四、同步化细胞的检测对各个时期的同步化细胞可通过流式细胞仪来鉴定其细胞周期，通过比较各时相细胞的百分比，看是否达到预期的目的。S期细胞可通过放射性自显影来鉴定结果，M期细胞可涂片，染色，在显微镜下观察染色体，统计有丝分裂指数来鉴定。,第五节、器官培养,一、器官培养的概念器官培养是指从供体取得器官或器官组织块后，不进行组织分离而直接在体外培养，保持其原有器官细胞的结构和联系。器官培养主要强调器官组织的相对完整性，重点观察细胞正常联系和排列情况，它们之间的相互影响和局部环境的生物调节作用。这样，就为实验生物学提供了既处于一定的组织结构之中又脱离于体内种种复杂因素的细胞群体。现代器官培养法采用把组织放置在细胞难以粘附的表面上，减少支持物与组织的接触面积，以及把组织包埋于琼脂中等方法，大大减少了细胞迁移现象，达到限制生长，是器官专一细胞同它们的基质细胞维持相对正常的结构关系的目的。离体器官需要特殊的培养条件。因此，器官培养的直径与厚度均以不超过12nm为宜，以使营养物，氧气和代谢废物易于进入或排出。为了，使得内部细胞有足够的氧气进入，一是将器官组织块放置在培养基气液面上，或者提高培养环境的氧分压，一般要加注纯氧。另外，还需要添加一些生长因子，激素等。器官培养方法很多，但均只能进行原代培养，不能连续培养。,二、器官培养方法,（一）表玻璃器官培养法即在一块表玻璃内加上鸡胚提取液和鸡血浆，凝固后将所培养的器官移植到上面，然后一起置于一培养皿内培养。（二）琼脂凝胶培养法其是一种在合成培养基的混合溶液中，添加少量的琼脂使其固化成固体培养基后，用来培养器官的方法。与血凝块比较，琼脂固体培养基的优点在于基质不液化，细胞在琼脂上的迁移受到抑制。,（三）擦镜纸培养法擦镜纸具有疏水性，可以漂浮在培养液表面作为培养器官的支持物，同时，培养液可以透过擦镜纸而进入培养器官的内部。需要注意的是，在将植块放于擦镜纸上面时，要尽量小心，以免下沉。（四）金属格栅器官培养法（五）琼脂小岛器官培养法用琼脂制成小岛状的支持物，放在液体培养基中，然后将要培养的器官置于琼脂上面进行培养。琼脂不但具有支持的作用，而且还可以防止培养器官的细胞发生迁移。这种方法可以在培养过程中直接观察植块的生长状况，换液也简便。此外，固相培养基和液相培养基共存，从而可在同一培养体系中加入不同的营养成分，使在同一培养系统中培养不同的器官成为可能。,