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蛋白质与蛋白质的相互作用研究方法蛋白质与DNA相互作用研究方法,蛋白质与蛋白质的相互作用的研究方法,酵母双杂交系统Yeast Two-Hybrid Systerm免疫共沉淀Co-immunoprecipitation (Co-IP)GST pull-down 技术荧光共振能量转移Fluorescent Resonant Energy Transfer （FRET）双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescent Complement）BIFC蛋白质芯片技术其它方法,酵母双杂交系统,1.1 酵母双杂交技术的原理 酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。他的产生是基于对酵母转录因子GAL4性质的研究. 基因转录不仅需要有特定的DNA顺式序列结构，而且也需要有反式转录激活因子的参与。 转录激活因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, DB)和转录激活结构域(activation domain, AD), 它们都是转录激活因子发挥功能所必需的。 单独的BD或AD都不能激活基因转录，但不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。,如果要研究两个蛋白之间有无相互作用，可以把这两个蛋白分别与DB和AD形成的融合蛋白。 与DB 融合的蛋白称为“诱饵”(bait)， 与AD融合的蛋白称为“猎物”(prey)。 如果这两个蛋白能发生相互作用, 这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活报告基因(reporter gene)的转录与表达。 通过检测报告基因的表达产物, 可判别“诱饵”和“猎物”这两个蛋白质之间是否存在相互作用。,1.1 酵母双杂交技术的原理,同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。,1.2 酵母双杂交操作主要流程1. 分别构建BD和AD融合蛋白载体2. 分别将重组载体转化酵母菌细胞3. 对酵母转化子进行自激活检测4. 将重组载体共转化酵母菌细胞5. 检测报告基因表达产物6. 分析酵母双杂交实验结果,BD,AD,BD,AD,BD,AD,x,Y,Identification and Characterization of FAM124B as a Novel Component of a CHD7 and CHD8 Containing Complex,实例,Method：For yeast two hybrid studies we generated the constructs FAM124B-1,3-pGADT7 (transcript variant 1) and FAM124B-1,2-pGADT7 (transcript variant 2)FAM124B-1,3-pGBKT7 (transcript variant 1, FAM124B-1,2-pGBKT7 (transcript variant ),These both plasmids were co-transformed into Y2HGold strain cells together with either the CHD7-CR1-3-pGBKT7 (amino acids 1591-2181) or the CHD8-pGBKT7 (amino acids 17892302) plasmids.,Tserendulam Batsukh, Yvonne Schulz,et.al.Identification and Characterization of FAM124B as a Novel Component of a CHD7 and CHD8 Containing Complex.PLoS One. 2012; 7(12): e52640,Yeast two hybrid assay.Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,3-pGADT7 (full length transcript variant 1) and CHD7-CR1-3-pGBKT7 (amino acids 1591-2181, demonstrating no direct interaction between FAM124B transcript variant 1 and the CHD7 part, while (B) Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,3-pGADT7 (full length transcript variant 1) and CHD8-pGBKT7 (amino acids 17892302, shows a direct interaction. The same experiments were performed for FAM124B transcript variant 2. (C) Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,2-pGADT7 (full length transcript variant 2) and CHD7-CR1-3-pGBKT7 (amino acids 1591-2181, (D) Direct yeast two hybrid experiment with the constructs FAM124B-1,2-pGADT7 (full length transcript variant 2) and CHD8-pGBKT7 (amino acids 17892302, FAM124B transcript variant 2 interacts directly with the CHD8 part, while no direct interaction with the CHD7 part could be observed.,酵母双杂交系统是一种在酵母细胞内分析蛋白质相互作用的技术。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含Transcription-activating domain的载体。另外还需要特殊的酵母菌株如GAL4缺陷型。,1.3 应用,它可用于：检验蛋白质间的相互作用；分析蛋白质相互作用的结构域；发现新的作用蛋白质。,1.4 酵母双杂交技术的优点：是一种细胞内蛋白质相互作用研究技术，比体外的蛋白质相互作用技术更接近生物体内的真实情况。基于基因重组技术和分子遗传学的原理，更便于观察和检测实验结果。酵母菌是一种低等真核微生物，能反映真核生物的基本生命现象和规律。4. 酵母菌生长迅速、容易培养，便于进行高通量、大规模的组学研究。,1.5 酵母双杂交技术的弱点：1. 假阳性：自激活、多因子参与假阴性：毒性蛋白、膜蛋白、难表达的蛋白低等真核细胞不能完全等同于高等真核生物的情况 酵母双杂交实验的结果必须经过多方面的验证，包括：体外相互作用验证 体外亲和纯化（GST pull-down）、体外免疫共沉淀哺乳动物细胞内验证 亚细胞共定位、体内免疫共沉淀,优点：生理条件下的结合缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用,二、免疫共沉淀,2.1 定义及原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。,2.2 方法1) 收获培养的细胞（11071108）冷PBS洗涤2次2）细胞裂解液裂解细胞，冰浴30min3) 12000rpm 离心 30min4）收集上清并加入适量抗体，4C摇动1h过夜5）加入ProteinA/G-Sepharose(琼脂糖凝胶)悬液， 4C摇动1h6）细胞裂解液洗涤ProteinA/G-Sepharose混合液7）离心弃上清8）沉淀加2蛋白Loading Buffer煮沸510min9）离心，上清液跑SDS-PAGE 胶10）考马氏亮兰染色、银染 Western Blot 质谱分析,3.注意事项1）细胞裂解 采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。 不能用高浓度的变性剂（0.2SDS)，细胞裂解液中要加各种蛋白酶酶抑制剂，如商品化的cocktailer。2）使用明确的抗体，有的抗体不适宜做免疫共沉淀。3) 对照实验的设计。,Identification and Characterization of FAM124B as a Novel Component of a CHD7 and CHD8 Containing Complex,实例,(A) Using the anti-CHD8 (abcam, ab84527) or the anti-CHD7 (abcam, ab31824) antibody for precipitation, we detected with the anti-HA antibody (Roche) an approximately 51 kDa band corresponding to the estimated size of FAM124B transcript variant 1. Lane 1: co-transfected Co-IP, lane 2: untransfected HeLa cells as negative control.,三、GST pulldown技术,3.1 定义及原理定义：该技术是通过以适当标签 和目的基因进行融合表达作为诱饵从细胞提取物中钓出与目的蛋白相互作用的蛋白。多组分蛋白质复合物的分离主要利用固定在琼脂糖树脂的反标签系统完成。原理：将诱饵蛋白质和用谷胱甘肽-s-转移酶(glutathione-transferase，GST）标签融合表达，一步纯化后与含有目的蛋白质的溶液进行孵育利用谷胱甘肽琼脂糖球珠将GST-融合蛋白-目的蛋白复合物沉淀下来，然后进行聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDSPAGE) 鉴定与诱饵蛋白质相互作用的蛋白质,两种应用： 1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用 2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用,3.2 方法： 1） GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a, 单一明确的重组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；c, 体外翻译cDNA表达得到的未知蛋白） 2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应 4C 2h 3）离心弃上清 4）沉淀加入2 蛋白Loading Buffer煮沸，离心 5）取上清进行SDS-PAGE电泳， 6）考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带，进一步做质谱分析确定沉降的蛋白；电泳后的胶也可以做Western Blot来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白注意：该实验设立GST对照，反应均在4C进行,右边为GST对照,3.3 GST 融合蛋白沉降实验结果,CK2,GST-TP1,GST,Fig 10 GST pull down assay M: protein molecular weight standard Lane 1: GST Lane 2: GST-TP1+ CK2 Lane 3: CK2,3.4 GST pull-down技术优缺点,优点：融合蛋白亲具有高通量性、高选择性的特点，由于融合蛋白的多样性以及表达系统的多样性(如细菌、果蝇、哺乳动物)，该方法能够研究蛋白质在复杂体系中的相互作用。缺点：该方法的成功应用取决于是否能够得到足够多，并且保持蛋白质活性的重组融合蛋白，以及如何避免内源性诱饵蛋白的干扰。,四、荧光共振能量转移（FRET） Fluorescence resonance energy transfer,4.1 荧光信号的产生 荧光基团在某波长的激发光刺激下，产生一个更长波长的发射光。,4.2 什么是FRET? 荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。,4.3 绿色荧光蛋白 60年代，Shimomura等首先从水母（Aequoria Victoria ）中分离出一种水母发光蛋白(aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母中提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白 GFP, 后经研究表明，在水母体内Ca2+和肠腔素与水母发光蛋白结合后，水母发光蛋白产生蓝色荧光，GFP在蓝光的激发下，产生绿色荧光 。,人们在GFP基因的基础上已经制造出蓝色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，青色荧光蛋白，又发现了红色荧光蛋白。,其中兰色荧光蛋白和绿色荧光蛋白，青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白之间可以发生荧光共振能量转移,Tsien & Miyawaki采用FRET技术检测细胞内Ca2+的浓度变化。他们将CFP和YFP分别于钙调蛋白和钙调蛋白结合肽融合表达于同一个细胞内。当细胞内具有高的Ca2+浓度时，钙调蛋白和钙调蛋白结合肽结合，可诱发FRET，使受体蛋白YFP发出黄色荧光，因此细胞呈黄色。当细胞内Ca2+浓度低时，FRET几乎不发生，因此检测时CFP被激发，发出绿色荧光，细胞呈绿色。,4.4 应用,在生命科学领域，FRET技术是检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。正如前述，当供体发射的荧光与受体发色团分子的吸收光谱重叠，并且两个探针的距离在10nm范围以内时，就会产生FRET现象。而在生物体内，如果两个蛋白质分子的距离在10nm之内，一般认为这两个蛋白质分子存在直接相互作用。,五、双分子荧光互补技术（BiFC） (Bimolecular Fluorescence Complementation),基本原理：方法利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)及其突变体的特性作为报告基因，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接.如果两个目标蛋白因为有相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光.在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱等情况。,将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段,分别与目标蛋白连接.如果两个目标蛋白因为有相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光,Identification of the SIRTUIN1 (SIRT1)-binding domain of BMAL1.,Binding of SIRT1 to BMAL1 deletion mutants was analyzed by bimolecular fluorescence complementation (BiFC). COS7 cells were transfected with plasmids encoding SIRT1-N-terminal of Venus (VN) and BMAL1-C-terminal of Venus (VC) wildtype (WT) or its various mutants (nuclear localization sequence NLS, BMAL1 without a functional nuclear localization signal; basic-helix-loop-helix bHLH, encoding BMAL1 71 to 140; Per-Arnt-Sim PAS-A, BMAL1 210 to 320; PAS-B, BMAL1 350 to 480; transcriptional activation domain TAD, BMAL1 553 to 625). The images were captured by fluorescence imaging microscopy using specific filter sets for yellow fluorescent protein and red fluorescent protein.,六、蛋白质芯片技术 蛋白质芯片可以用来大规模筛选蛋白之间的相互作用。将荧光标记的探针蛋白与蛋白质芯片孵育，洗脱非特异性结合的蛋白后，可以通过扫描芯片上的荧光点检测到稳定的相互作用蛋白点 。,Gong W. et al. (2008) Molecular Plant1: 27-41.,其它蛋白互作技术,串联亲和纯化（TAP） 表面等离子共振（SPR） 噬菌体展示技术(phage display approach) 融合蛋白亲和色谱法(protein fusion affinity chromatography) 原子作用力显微技术(atomic force microscopy, AFM ),蛋白质与DNA相互作用 （一）酵母单杂交系统（Yeast one-hybrid system） 该技术是上世纪90年代中发展起来的研究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术，在酵母细胞内研究真核生物中DNA-蛋白质之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。,基本原理：将顺式作用元件与最基本启动子（minimal promoter，Pmin）相连并将报告基因连到Pmin下游，将待测转录因子cDNA与酵母转录激活结构域（transcription-activating domain, AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就激活Pmin启动子，报告基因表达。,从拟南芥cDNA文库中筛选与顺式元件DRE结合的转录因子示意图。,（二）噬菌体展示技术,基本原理：将已知的启动子DNA片段与固相支持物结合； 以改构的噬菌体为载体，把待选基因片段（编码启动子DNA结合蛋白的cDNA）定向插入噬菌体外壳蛋白基因区，形成的融合蛋白表达在噬菌的表面，不影响噬菌体的生活周期及天然构型。外源蛋白或多肽表达于噬菌体的表面，与固定或固相支持物结合，通过适当的淘洗，洗去非特异性结合的噬菌体(即亲和富集法)，选出目的噬菌体，而编码基因作为病毒基因组的一部分可通过分泌型噬菌体的单链DNA测序得知.,（三）DNAase I 足迹实验,足迹试验不仅能找到与特异性DNA结合的目标蛋白，而且能告知目标蛋白结合在哪些碱基部位，足迹试验的方法较多，常用的有DNase 足迹试验、硫酸二甲酯足迹试验(dimethylsulfate，DMS)，二者原理基本相同.,DNase 足迹试验的基本原理为: 蛋白结合在DNA片段上，保护结合部位不被DNase破坏，这样，蛋白质在DNA片段上留下了“足迹”，在电泳凝胶的放射性自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带。,技术流程为： (1)待检双链DNA分子用P32作末端标记，通常只标记一端; (2)蛋白质与DNA混合，等二者结合后，加入适量的DNase ，消化DNA分子，控制酶的用量，使之达到每个DNA 分子只发生一次磷酸二酯键断裂，同时设未加蛋白质的 对照; (3)从DNA上除去蛋白质，将变性的DNA加样在测序凝胶中 作电泳和放射性自显影，与对照组相比后解读出足迹部 位的核苷酸序列.,（四）CHIP (Chromatin Immunoprecipitation),染色质免疫沉淀技术, 一种可用来确定与某一特定蛋白结合或蛋白定位所在的特异性DNA序列的技术,（五）EMSA (电泳迁移率实验),
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