《抗生素发酵工艺》PPT课件.ppt

抗生素发酵工艺,一、概述 利用微生物技术，通过高度工程化的新型综合技术，以利用微生物反应过程为基础，依赖于微生物机体在反应器内的生长繁殖及代谢过程来合成一定产物，通过分离纯化进行提取精制，并最终制剂成型来实现药物产品的生产。,绪论,二、抗生素的发展史,我国早在宋朝真宗（998-1022）年代就开始利用接种人痘的免疫技术预防天花病。 1796年英国医生E.Jenner利用接种牛痘苗预防天花并获得成功。,1929：Fleming在葡萄球菌培养皿中，污染的霉菌周围出现透明的抑菌圈。 杀菌物质，断言太不稳定，无法分离并用作药物。 1939：牛津病理家Howard Florey，化学家Ernst Chain，Norman Heatley.发酵瓶培养霉菌，培养里提取测活性，青霉素结晶。,1940:8只注射链球菌，提取物对4只治疗。未经治疗鼠在24小时内死亡，治疗鼠存活数天至数周。 1941年2月开始治疗第一批人类病人。 1943：威斯康辛大学小组，取得突破 生产菌表面培养：几十个单位 深层培养产黄青霉：100U/ml X、UV诱变育种：1000-1500U/ml 不产色素变种：66000-70000U/ml,1941年，美国辉瑞制药公司开始介入青霉素的试验性生产，使用了生产柠檬酸已经非常成熟的通入无菌空气并进行搅拌的深层发酵法。这种方法给发酵工业带来了革命性的变化。自此以后制药业走进了抗生素时代 我国微生物发酵制药工业起步较晚，1953年，我国第一家青霉素生产厂上海第三制药厂才建成投产。 1958年，我国最大的抗生素制药企业华北制药厂在石家庄建成投产，主要产品为青霉素、链霉素、土霉素和红霉素等。,三、抗生素药物的分类,抗细菌：青霉素、红霉素、四环素 抗真菌：两性霉素B、制霉菌素、灰黄霉素 抗肿瘤：丝裂霉素、诺卡霉素 抗病毒：阿糖腺苷、金刚烷胺,四、微生物发酵研究范围,微生物发酵制药是利用微生物进行药物研究、生产和制剂的综合性应用技术科学。研究内容包括微生物制药用菌的选育，发酵以及产品的分离和纯化工艺等。 主要讨论用于各类药物发酵的微生物来源和改造、微生物药物的生物合成和调控机制、发酵工艺与主要参数的确定、药物发酵过程的优化控制、质量控制等。,第一章 微生物药物的产生菌,常见的制药用微生物 细菌 放线菌 真菌,细菌之芽孢杆菌属(Bacillus),放线菌,抗生素12000余种，60%左右来自放线菌，经济价值大。,放线菌之诺卡氏菌属 (Norcadia),生产利福霉素、蚊霉素等,放线菌之小单胞菌属 (Micromonospora),多种可产抗生素，如棘孢小单胞菌(M. echinospora)产庆大霉素。,放线菌之游动放线菌属 （Actinoplanes）,典型代表： 济南游动放线菌 (Actinoplanes tsinanesisn) 产创新霉素(creatmycin；1964),真菌之曲霉属(Aspergillus),生产枸橼酸、葡萄糖酸、有机酸类、抗生素，进行甾体转化。,真菌之青霉属(Penicillum),产黄青霉(Penicillum chrysogenum) 生产青霉素，也可用来生产葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏血酸,真菌之头孢霉菌属(Cephalosporium),产黄头孢霉(Cephalosporium chrysogen)、 顶孢头孢霉菌(Cephalosporium acremonium) 都生产头孢菌素C,第二节 制药微生物的育种,菌种选育 菌种筛选 菌种保藏 菌种的退化和复壮,一、发酵菌种的选育要求,生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢产物的产量高，其它类似代谢产物少 操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离 稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯粹，遗传性状稳定、不易变异退化 安全性：非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素,发酵菌种的选育方法,从自然界中获得新菌种 诱变育种 杂交育种 原生质体融合 基因工程,（1）从自然界中获得新菌种,土壤、空气、动植物等，严重污染的水域，极端环境等 基本程序： 采样预处理富集培养筛选鉴定野生型菌株,（2）诱变育种,物理或化学方法诱发突变 物理诱变剂：紫外线、X-射线、-射线等 化学诱变剂：氮芥、亚硝酸、5-氟尿嘧啶等,杂交育种：借助有性重组，使不同菌株的遗传物质得以交换 原生质体融合育种：借助原生质融合技术实现遗传物质的交换 基因工程育种：DNA体外重组技术定向育种，技术含量高，应用面广,二、菌种筛选,（1） 随机筛选 摇瓶筛选法、琼脂块筛选法 （2）理性化筛选 筛选前体或前体结构类似物抗性突变株 筛选营养缺陷型突变株,三、菌种保藏(Culture conservation),目的：保证菌种经过较长时间后仍保持生活能力，防止被杂菌污染，形态特征和生理形状尽可能不发生变异。,原理：根据微生物的生理、生化特性，人工创造条件（如干燥、低温、缺氧、缺乏营养等）使微生物代谢活动处于不活泼状态，使其存活且得以延续。在进行保藏时最好是选用菌种的休眠体，如芽孢、孢子。通过保藏可以减少微生物的新陈代谢，降低菌种变异的几率。,菌种保藏三要素,典型菌种的优良纯种的休眠体； 创造有利于种子休眠的环境（低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养）； 尽可能采用多种不同的手段保藏同一菌株。,菌种保藏的常用方法,斜面低温保藏法 石蜡油封存法 砂土管保藏法 麸皮保藏法 甘油悬液保藏法 冷冻真空干燥保藏法 液氮超低温保藏法 宿主保藏法,菌种保藏机构 ATCC（美国典型菌种保藏中心） CMCC (中国医学微生物菌种保藏管理中心) NBRC (日本技术评价研究所生物资源中心),四、菌种的退化和复壮,退化： 基因突变 连续传代 环境不良或污染了杂菌,生产能力下降 抵抗不良环境条件能力减弱,复壮,纯种分离 粗放、精细 寄主复壮 选择合适的培养条件 改变营养成分、酸碱度、培养温度,第二章 培养基,第一节 培养基的成分,原则： 根据菌种特性、微生物生长发育阶段、发酵产物特点等因素合理配制使用不同成分及配比的培养基，为微生物提供适宜的营养物质，以满足菌体生长和合成产物的需求。,一、碳源 工业常用： 糖蜜（营养丰富，物美价廉） 玉米淀粉及其水解液（克服葡萄糖代谢过快的弊病） 油脂（消除泡沫） 糊精,第一节 培养基的成分,二、氮源,有机氮源： 黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、鱼粉 无机氮源： 铵盐、硝酸盐、氨水,三、无机盐和微量元素,磷（链霉素、四环素） 硫（青霉素、头孢菌素） 铁（青霉素、四环素、麦迪霉素） 镁（卡那霉素、新生霉素、链霉素） 锌（链霉素、青霉素） 氯（金霉素、灰黄霉素）,四、前体,前体是指加入到发酵培养基中的能够直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去而自身结构没有显著变化的一类小分子物质。 注意：少量多次,五、促进剂和抑制剂,促进剂是指那些既不是营养物质又不是前体却能提高产物产量的添加剂。 抑制剂是指在发酵过程中会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另一代谢途径活跃，从而获得人们所需的某种产物或是正常代谢的某一代谢中间产物积累起来。,六、生长因子,那些对微生物生长不可缺少的微量有机物质，微生物不能通过普通的碳源、氮源合成这些物质，需另外添加，包括维生素、氨基酸、嘌呤碱和嘧啶碱及其衍生物。,第二节 培养基的类型,类别：按组成成分分 合成培养基：成分明确、稳定，多用于研究和育种，不适合大规模生产。 天然培养基：天然动植物产品，营养丰富、价格低廉、适于工业生产。,按培养基的物理状态分,固体培养基：适合菌种的培养和保存 半固体培养基 液体培养基：适合发酵工业大规模使用,按培养基的生产用途分,孢子培养基 供菌种繁殖孢子用的，常采用固体培养基。 条件：培养基营养不要太丰富 无机盐浓度适当 培养基的PH值要适中 常用：麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米培养基,二、种子培养基,种子培养基是供孢子萌发和菌种生长繁殖用的培养基，营养成分要比较丰富、完全、易被菌体利用。 营养成分：葡萄糖、糊精、蛋白胨、玉米浆、酵母粉、硫酸铵等。,三、发酵培养基,发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物用的培养基。 注意：碳氮源速效和迟效的相互搭配，少用速效营养，多加迟效营养，比例适宜。,第三节 培养基的设计与选择,一、培养基的设计 遵循的原则： 1、营养物质满足微生物生命活动的需要 2、营养物质的浓度及配比适当 3、PH值适宜 4、符合培养的目标 5、原料来源广泛，价格合理,二、培养基的选择,1、液体培养基和固体培养基的选择 液体培养基：种子培养及大规模发酵生产。 固体培养基：微生物菌种的分离、纯化及保存、菌落特征鉴定、活细胞数目测定 2、根据微生物的营养特点选择培养基,3、依据生产实践和科学实验的要求选择培养基 4、考虑培养基的成本 选择原则： 产物或菌体得率大的 降低产品的分离提纯成本 生产能力最高的 副产品生成最少 原料质量稳定，供应充足 工艺过程较易进行,第四节 影响培养基质量的因素,一、培养基组成配比的影响 二、培养基原材料质量的影响 三、水质的影响 四、灭菌的影响 五、其他因素的影响,一、培养基组成配比的影响,氮源过多：菌体生长旺盛，PH值偏高，不利于代谢产物积累。 氮源不足：菌体繁殖量过少，影响产量。 碳源过多：PH值偏低。 碳源不足：易引起菌体衰老和自溶。,二、培养基原材料质量的影响,有机氮源（黄豆饼粉、玉米浆）、配制培养基（蛋白胨）、碳源（油脂） 消除原则：在工业生产中必须严加控制，按质量标准进行分析检验，合乎标准的原材料方能使用。,三、水质影响,孢子培养基用蒸馏水货深井水，种子培养基、发酵培养基用深井水或自来水，发酵生产中有的使用地表水，但是必要时要经过适当处理才能使用。,四、灭菌的影响,严格控制灭菌操作，力求达到既灭杂菌又减少营养成分的损失，对那些易降解或易发生化学反应的组分应单独灭菌。,五、其他因素影响,1、培养基的PH值 培养基PH值的调节应主要通过改变培养基营养物质的浓度比例，特别是生理酸、碱性物质的用量来完成。少量培养基的PH值可用缓冲液加以缓冲。 2、培养基的黏度 黏度适宜,第三章 灭菌,第一节 灭菌的原理和方法 灭菌是指用物理的或化学的方法杀灭或除掉物料及设备中所有生命有机体的过程。 一、常用的灭菌方法 化学物质灭菌 辐射灭菌 过滤介质灭菌 加热灭菌（干热灭菌、湿热灭菌）,1、化学物质灭菌 试剂：甲醛、苯酚、高锰酸钾、新洁尔灭、乙醇、过氧乙酸、漂白粉等。 适用范围：生产环境或小型器具。不适用于培养基的灭菌。 2、辐射灭菌 用于灭菌的射线包括紫外线、X射线、射线，其中以紫外线最常用。 紫外线主要用于无菌室、培养间等空间的灭菌。,3、过滤介质除菌 主要用于澄清液体及气体的除菌 4、加热灭菌 （1）干热灭菌 火焰灭菌： 主要用于金属接种工具、试管口、锥形瓶口、接种移液管和滴管外部及无用的污染物或实验动物的尸体等灭菌。 金属小镊子、小刀、玻璃涂棒、载玻片、盖玻片灭菌时，应先将其浸泡在75%酒精溶液中，使用时从酒精溶液中取出来，迅速通过火焰，瞬间灼烧灭菌。,热空气灭菌 生产上常用的灭菌条件为160-170、1-1.5h。 （2）湿热灭菌 利用饱和蒸汽灭菌。广泛用于工业生产中大量培养基、设备、管路及阀门的灭菌。,二、湿热灭菌原理,热阻:指某一微生物在某一种特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。 相对热阻：指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。,第二节 培养基和发酵设备的灭菌 过程,一、灭菌前的准备工作 设备检查,二、培养基及发酵设备的灭菌,（一）空罐灭菌 空罐灭菌又称空消，是指将饱和蒸汽通入未加培养基的发酵罐或种子罐内，进行罐体湿热灭菌的过程。 优点：罐内死角少，蒸汽传热效率高，灭菌效果好。 适用范围：没有使用的发酵罐、染菌罐、发酵罐更换菌种、培养基连续灭菌工艺、发酵罐及附属设备。,（二）实罐灭菌,实罐灭菌又称为分批灭菌，是将饱和蒸汽直接通入装有配制好的培养基的发酵设备中进行灭菌的一种方法，简称实消。 优点：不需要专门的灭菌设备，投资少，操作简单，灭菌效果可靠。 缺点：设备利用率较低；灭菌过程需要时间较长，培养基营养成分破坏较多。 该法多用于中小型发酵罐和种子罐的灭菌。,注意：,1、原料切忌结块，配料时应开动搅拌器，将各种粉饼块打碎、搅拌均匀。 2、凡进口在培养基液面下的管道应不断通入蒸汽，在液面上的其余各管应排放蒸汽，这样才能保证灭菌彻底，不留死角。 3、灭菌工程中要不时地搅拌，以利于泡沫破裂。,（三）连续灭菌,连续灭菌是将培养基在发酵罐外，通过专用灭菌装置，连续不断加热，维持保温和冷却后，送入已灭菌的发酵罐内的工艺过程，又称连消。 优点：发酵罐利用率高；热能利用较合理，适于自动化控制。 缺点：设备多，投资大，中小型发酵生产企业应用较少。,根据灭菌过程中使用的设备及工艺，将连消分为三种形式：,1、由连消塔、维持罐和冷却器组成的灭菌系统 该灭菌系统使用的设备包括：配料罐、连消塔、维持罐、冷却器。 2、蒸汽喷射连续灭菌系统 喷射式加热器在国内大多数发酵工厂采用的培养基加热装置。 3、由热交换器组成的灭菌系统 板式热交换器传热系数大，流程利用合理，节省大量的蒸汽和冷却水，因而广泛利用。,三、发酵罐附属设备、空气过滤器及管路等的灭菌,（一）发酵罐附属设备的灭菌 包括补料罐、计量罐和油罐等。 空罐灭菌使罐内蒸汽压力达到1.5105Pa，保温45min。 补料罐的实罐灭菌条件应视物料性质而定。,（二）空气过滤器的灭菌,灭菌时，总蒸汽压力为（3-3.5）105Pa，总过滤器保温灭菌时间为1.5-2h，吹干时间为2-4h；中小型过滤器一般保温45-60min，吹干需1-2h。,（三）管路的灭菌,管路灭菌所用的蒸汽压力一般为（3-3.5）105Pa，灭菌保温时间为1h,二、培养基及发酵设备的灭菌,（一）空罐灭菌 定义：又称空消。是指将饱和蒸汽通入未加入培养基的发酵罐或种子罐内，进行罐体湿热灭菌的过程。 优点：空罐灭菌时，罐内死角少，蒸汽传热效率高，灭菌效果好。,第三节 常见灭菌问题的分析及处理,一、影响培养基灭菌的因素 培养基成分 油脂、糖类、蛋白质、有机物需要灭菌温度高；盐类、色素有利于灭菌的进行。 PH值 培养积极的PH值愈低，灭菌所需的时间愈短。 培养基中的颗粒大小 1mm的颗粒影响不大。 泡沫 加入少量消泡剂,二、灭菌过程中常见的问题及处理方法,灭菌后培养基质量差 控制好灭菌温度及灭菌时间、调整好原料的灭菌顺序 空气突然中断 关闭个空气进气阀。处理顺序：发酵罐种子罐补料罐消沫剂罐计量罐。 蒸汽压力变化 空气过滤器压差过大 饱和蒸汽温度与压力不对应 消后培养基带菌：设备损坏、密封不严以及空气过滤系统带菌等,第四章 种子的扩大培养,种子的制备是指由保藏的菌种开始，经过不断的扩大培养，使菌体数量达到能够满足生产中发酵罐或者实验室摇瓶发酵接种量的需要所涉及的菌种培养的过程。,适合于工业化发酵生产的种子必须满足以下条件： 1、生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，延滞期短。 2、菌体的生理特性及生产能力稳定。 3、菌体总量及浓度能满足发酵罐接种量的要求。 4、无杂菌污染。,以抗生素发酵生产的种子制备过程为例： 其种子的制备一般包括在固体培养基上生产大量孢子的制备过程和在液体培养基中培养大量菌丝的种子制备工程。,第一节 固体孢子制备,一般繁殖能力强、孢子数量多的菌种可用固体孢子进罐。 一、孢子制备的过程 1、霉菌孢子制备 多数采用大米、小米、麦麸之类的自然培养基。 优点：培养基简单易得、成本低、培养基比表面积大，获得孢子数量比营养琼脂斜面多。,e.g 产黄青霉菌(P.chrysogonum) 原始菌种 斜面试管 获得孢子 250ml 茄 子瓶（大米或小米） 25 28 ，414天 成熟（在 真空下抽去水分，使水分含量在10%以下，于4 冰 箱保存）。,对于不产孢子的赤霉素生产菌（Gibberelline fujikuroi），也可用大米固体培养基在茄子瓶中培养菌丝体，用作种子罐种子。 产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌（Sgriseus ），产卡那霉素的卡那链霉菌（Skanamyceticu），可以用摇瓶液体培养法，孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇床上培养，获得菌丝体，作为种子。 不产孢子的细菌，如生产谷氨酸的棒状杆菌（Corynebacterium）、短杆菌（Brevibacterium），生产上一般采用斜面营养细胞进行扩培，再转入液体摇瓶培养，获得细胞悬液再接种。,2、放线菌孢子制备 放线菌的孢子多数采用琼脂斜面培养基来制备，培养基中含有适合产孢子的营养成分，如麸皮、蛋白胨和一些无机盐类物质等。 放线菌的发酵生产工艺流程： 沙土管母斜面子斜面种子罐发酵罐 沙土管母斜面摇瓶菌丝种子罐发酵罐,3、细菌孢子制备 发酵生产的工艺流程： 安剖管斜面F1（第一代）斜面F2（第二代）种子罐发酵罐 细菌的培养温度多为37，培养时间一般为1-2天。,二、孢子制备的技术要点,1、霉菌类 菌落分散、挑选菌落中央的孢子、孢子悬液浓度适当、混合均匀。 2、放线菌类、细菌类 灭菌后的琼脂培养基在放凉且未凝固时摆成斜面。待斜面凝固后置37培养2-3天，经检查无杂菌和无冷凝水后备用。,第二节 液体种子制备,液体种子的制备是将固体培养基上培养好的孢子或菌体转入到液体培养基中培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。 生产种子的制备包括：摇瓶种子制备和种子罐种子制备。,一、摇瓶种子制备,将斜面种子或米孢子接种入装在锥形瓶内的液体营养培养基中，在摇床上进行振荡培养所获得的液体种子，称作摇瓶种子。 1、工艺流程 培养基配制分装灭菌接种恒温振荡培养摇瓶种子 斜面种子或米孢子,2、培养基配制 培养基的配方和培养条件与种子罐相似，要求氮源丰富，利于菌丝生长。 3、接种 采用菌悬液接种法，即用无菌蒸馏水将斜面种子或米孢子粒上的细胞或孢子洗下，制成细胞或孢子悬液，按一定题解或者一定细胞数接种至摇瓶种子培养基中。 4、培养 摇瓶种子在恒温摇床上进行培养。摇床分旋转式和往复式，抗生素工厂一般采用的是旋转式。,5、保存 摇瓶种子应当在培养成熟后立即使用。如果不使用，可置4冰箱中保存，保存期最好不要超过3天。,二、种子罐种子制备,种子罐的作用是使接入种子罐内数量有限的孢子发芽、生长并繁殖成大量菌体，满足接种发酵罐的需要。 孢子或者摇瓶菌丝接入到体积较小的种子罐中，经过培养后形成大量的菌丝，该种子称为一级种子。 把一级种子转入到发酵罐内发酵，称为二级发酵。 种子罐级数越少越好，原因： 1、简化生产工艺和控制 2、减少接种带来的染菌机会,接种量(seed volume)指移入的种子的体积和接种后培养液的体积比。 接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中的繁殖速度。 采用较大接种量可以缩短发酵罐中菌体繁殖到达高峰的时间，使产物形成提前。 原因：1、种子多，种子液中含有大量的胞外水解酶，有利于对基 质的利用 、生产菌迅速占据了整个培养环境，减少染菌机会。 但过多，易使菌体（菌丝体）生长过快，培养液粘度增加，溶氧降低，产物合成受影响。 e.g. 嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶 接种1%，酶活最高；1.5%4%影响不大；大于4%，酶产量明显下降。,第三节 种子质量的控制与分析,发酵生产水平 种子质量 菌体本身的遗传特性和培养条件,一、影响孢子质量的因素及其控制,1、培养基 原材料的产地、品种、加工方法以及用量 水质（地区、季节和水源污染） 菌种不同 氮源品种,2、培养条件, 温度 培养温度控制低一些，有利于孢子的形成。 湿度 在北方相对湿度控制在40%-45%，而南方相对湿度控制在35%-42%，所得孢子质量较好。 真菌对湿度要求偏高，而放线菌对湿度要求偏低。 培养时间 过于年轻的孢子经不起冷藏，过于衰老的孢子会导致生产能力下降，孢子的培养时间应控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。,接种量 一般传代用的斜面孢子要求菌落分布较稀，适于挑选单个菌落进行传代培养。接种摇瓶或进罐的斜面孢子，要求菌落密度适中或稍密，孢子数达到要求标准。,二、影响种子质量的因素及其控制,1、培养基 要求 氮源和维生素含量较高；营养成分尽可能与发酵培养基接近。 2、培养条件 选择最适温度；前期需氧量较少，后期需氧量较多，应适当增大供氧量；补料工艺 3、种龄 在工业发酵生产中，一般都选在生命力最旺盛的对数生长期，菌体量尚未达到最高峰时移种。,4、接种量 多数抗生素发酵的接种量为7%-15%，有时可加大到20%-25%。,三、种子质量标准,1、种子的生长状况 菌体形态、菌体浓度以及培养液的外观，是种子质量的重要指标。 2、营养物质含量与PH值变化 3、产物生产量 4、特殊酶活力,四、种子异常分析,1、菌种生长发育缓慢或过快 通入种子罐的无菌空气温度较低或培养基的灭菌质量较差是种子生长、代谢缓慢的主要原因。 2、菌丝结团 菌丝结团和搅拌效果差、接种量小有关。 3、菌丝黏壁 菌丝黏壁主要原因是搅拌效果不好，搅拌时泡沫过多，以及种子罐的装料系数过小等。,第四节 青霉素生产的种子制备,制备过程 安剖管斜面孢子大米孢子一级种子二级种子发酵,一、斜面孢子,培养基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等 培养条件：25、7天、湿度50% 培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细,二、大米孢子,培养基：大米及氮源（玉米浆） 培养条件：25、7天、控制湿度 培养基特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和养的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。,3、一级种子 培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆 培养条件：27，40小时 接种量：200亿孢子/吨 目的：长菌体 4、二级种子 培养基：同上 培养条件：27、10-14小时 接种量：10%,种子的质量要求,菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于3-4期。 青霉素发酵菌丝体的生长期共分6期，1-4期为年青期，4-6期合成青霉素的能力最强。,第五章 无菌空气的制备,第一节 过滤除菌的基本原理 一、基本概念 无菌空气：指不含有微生物菌体的空气。 深层过滤：利用介质纤维的层层阻隔，迫使空气在流动过程中出现无数次改变汽速大小和方向的绕流运动，导致微粒与滤层纤维间产生撞击、拦截、布朗扩散、重力及静电引力等作用，从而把微粒截留、捕集在纤维表面上，实现了过滤除菌的目的。,二、深层介质过滤除菌原理 扩散截留效应 重力沉降截留效应 惯性冲击截留效应 拦截截留效应 吸附截留效应,第二节 常见的过滤介质,一、纤维过滤介质 1、棉花 要求新鲜，纤维长二疏松，填充均匀，最后压紧，不得使用脱脂棉。 2、玻璃纤维 阻力小,二、颗粒活性炭过滤介质 该介质过滤强度高，表面积大，空隙大，阻力小，过滤效率低，只有棉花阻力的1/12，常与棉花配合使用。,三、纸过滤介质,1、超细玻璃纤维过滤 用无碱玻璃，喷吹成丝状纤维，属高气速过滤，气流速度越高，效率越高。但是其强度高，易断，多用于分过滤器。可采取的措施：环氧树脂；多层复合使用。 2、聚丙烯纤维滤纸 结构强度好，不易被水汽浸润。,四、板过滤介质,1、石棉滤板 对人体危害较大，目前使用已经较少。 2、烧结金属板 金属粉末颗粒经烧结形成的多孔固体材料。,五、膜过滤介质,膜过滤是接近于绝对过滤原理的过滤方式，可完全截留病毒、噬菌体、微生物孢子等微小生物体。耐121反复蒸汽灭菌，公认的最安全，保险。 1、PVDF 2、HFGF 3、PTFE Milipore公司：孔径0.1-0.22，小于细菌直径。 Domnick-Huntev公司：0.01，小于噬菌体。,第三节 无菌空气的制备过程,1、空气除菌流程： 空气高空取气管除尘器空气压缩机贮气罐一级冷却器油水分离器二级分离器除雾气加热器总过滤器分过滤器无菌空气进发酵罐,一、空气的预处理过程,1、空气的采集和压缩 采集：空气采集口一般设置距离地面至少10-15m，远离尘埃集中位置，尽量设置于上风口方向；空气自采集口进入空气压缩机前先通过粗过滤装置去除大的尘埃颗粒。 压缩：涡轮空压机和往复式空压机,2、压缩空气除油水,气液分离器：旋风分离器和丝网过滤器，一般联合使用。,3、空气再加热,热交换器或空压机输送的高温压缩空气与冷却空气进行热量交换,二、空气过滤除菌,1、发酵车间设置总过滤器一组，对预处理后压缩空气进行粗过滤，总过滤器主要使用膜过滤装置。 2、进入发酵罐之前设置分过滤器，一般由预过滤器和精过滤器组成。预过滤器目的保护精过滤器；精过滤器目的完全滤除空气可能含有的为生物体，确保进罐空气达到工艺无菌要求。,第四节 无菌空气的微生物检测,空气微生物检测方法有平皿沉降法和采样培养法 两大类型。 平皿沉降法依靠空气中的微生物体自然沉降于琼脂平板上，用过一定时间的收集后培养计数。 采样培养法则通过采集装置主动采集空气中微生物离子，通过培养检测空气中微生物含量水平。,实际操作中，考虑到无菌压缩空气的特殊性，一般不采用普通空气微生物的采集方法。采用的方法主要有液体吹气培养法和液体吹气-平皿培养法。,第六章 微生物药物的生物合成,第一节 微生物的代谢 代谢 初级代谢：微生物用于自身生长繁殖的营养物质的分解合成。 次级代谢：某些微生物生长到稳定期后以结构简单、代谢途径明确、产量较大的初级代谢产物为前体，通过复杂的次生代谢途径所合成各种结构复杂的化合物。,二、微生物的初级代谢和次级代谢的关系,第二节 微生物药物生物合成的基本途径,一、微生物次级代谢产物生物合成的基本特征 合成滞后性 受初级代谢的调节性 菌种与产物的不对应性 代谢产物的不确定性 代谢产物合成的不稳定性,二、次级代谢产物的生源,1、聚酮体 2、糖类 3、肽类抗生素中的不常见氨基酸 4、非核酸的嘌呤碱和嘧啶碱 5、吩恶嗪酮 6、莽草酸 7、甲羟戊酸,1、聚酮体,聚酮体即含多个羰基的聚合物 聚酮体的组成单位 乙酸、丙酸、丁酸和短链脂肪酸 聚酮体的起始单位 乙酰辅酶A、丙酰辅酶A、丙二酰胺辅酶A和丁酰辅酶A等 聚酮体的延伸单位 丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A、乙基丙二酰辅酶A等,3、肽类抗生素中不常见的氨基酸,二、次级代谢产物生物合成的基本途径,1、前体聚合 2、修饰 3、不同组分的装配,第三节 微生物次级代谢产物生物合成的调节机制,1、初级代谢对次级代谢的调节 2、碳代谢物的调节 3、氮代谢物的调节 4、磷酸盐的调节 5、ATP调节 6、酶的诱导调节 7、反馈调节 8、细胞膜通透性调节 9、金属离子和溶解氧的调节,初级代谢的调控机制,1、酶活力调节 酶的激活和抑制 2、酶合成调节 酶的诱导和阻遏,1、初级代谢对次级代谢的调节,当初级代谢与次级代谢具有共同的途径，而初级代谢产物过量时，往往会抑制次级代谢产物的合成。,2、碳代谢物的调节,速效碳源葡萄糖效应，一般情况下，凡能被微生物快速利用、促进菌体快速生长的碳源，对次级代谢产物合成都表现出抑制作用。是葡萄糖的降解产物抑制了包括几乎所有的微生物药物的次级代谢产物的合成。 调节方式：少量多次流加；菌体生长和产物发酵其采用不同的碳源。,3、氮代谢物的调节,研究发现：高浓度的铵离子抑制次级代谢产物的合成是一个普遍的特征；无机氮源或简单的有机氮源能促进菌体生长，却不利于次级代谢产物合成；而利用较慢的氮源可以防止和减缓但代谢物的阻遏作用，从而有利于次级代谢产物合成。 其调节应针对不同氮源区别对待。菌体生长期可以添加无机铵盐，而产物合成期采用复杂氮源。,4、磷酸盐调节,促进初级代谢，抑制次级代谢 抑制次级代谢产物前体的形成 阻遏次级代谢产物合成中某些关键酶的合成 抑制碱性磷酸酯酶的合成 增加菌体能荷状态以促进初级代谢,5、ATP调节,ATP直接影响次级代谢产物合成和糖代谢中某些酶的活性。以四环素的合成为例：,6、酶的诱导调节,在次级代谢过程中，有些参与次级代谢产物合成的酶为诱导酶，需要有诱导物存在时才能合成。诱导物一般为酶的底物或底物类似物。有些需外源加入，有些可以内源产生。,7、反馈调节,与初级代谢产物的调节机理类似，诱导调节通过底物（诱导剂）诱导后，特异性酶才会被诱导产生；反馈调节则是由于产物的过量积累导致的。,8、细胞膜通透性调节,通过调节膜的通透性，影响摄入前体或排出产物而加速次级代谢产物的合成，提高其产量。,9、金属离子及溶解氧的调节,金属离子，特别是二价阳离子，如Ca2+ 、Mg2+ 可以解除产生菌对所产抗生素的特异性吸附作用，使抗生素从菌丝上游离下来，促进产物分泌。,第七章 微生物发酵及工艺控制,第一节 发酵过程原理 一、发酵的基本概念 1、微生物发酵 利用微生物体来制得产物的需氧或厌氧的任何过程。 2、初级代谢产物 关系到微生物新陈代谢过程中的能量代谢、细胞生长和细胞结构的代谢产物。 3、次级代谢产物 微生物菌体在生长期不能合成的、一般在菌体生长静止期中合成的与菌体成长繁殖无明显关系的产物。,二、发酵的基本类型,1、生长关联型 特点：菌体生长、碳源利用和产物形成几乎都在相同的时间出现高峰。 2、生长部分关联型 特点：发酵的第一时期菌体迅速增长，而产物的形成很少或全无；在第二时期，产物以高速度形成，生长也可能出现第二个高峰。 3、非生长关联型 特点：产物形成一般在菌体生长接近或达到最高生长时期，即稳定期,三、发酵方法,微生物发酵有三种方式： 分批发酵（batch fermentation） 补料分批发酵（fed-batch fermentation） 连续发酵（continuous fermentation） 工业上防止出现菌种衰退和杂菌污染等实际问题，大都采用分批发酵或补料分批发酵这两种方式。,三、发酵方法,1、分批式发酵（batch fermentation） 理论基础 把培养液一次性装入发酵罐，灭菌后接入一定量的种子液，在最佳条件下进行发酵培养。 操作过程 大型发酵罐，一般不在罐内对培养基灭菌，而是利用专门的灭菌装置对培养基进行连续灭菌。 优缺点： 发酵周期短，产品质量易控制，不易发生杂菌污染，对原料组成要求较粗放。 发酵体系中开始时基质浓度很高，到中后期营养物质浓度很低，这对发酵反应不利。,2、流加式发酵,理论基础 在分批式操作的基础上，开始时投入一定量的基础培养基，到发酵过程适当时期，开始连续补加碳源或氮源或其他必需物质，但不取出培养液，直到发酵终点，产率达最大化，停止补料，最后将发酵液一次全部放出。 操作过程 操作形式有两种：反馈控制和无反馈控制。 无反馈控制包括定流量和定时间流加。 反馈控制根据反映体系中酸性物质的浓度来调节流加速率。,优缺点： 优点：在发酵过程中慢慢地加入培养基，使其在发酵液中保持适宜水平，同时又稀释了生成的产物浓度，避免了高浓度产物和底物的抑制作用，也防止了后期养分不足而限制菌体生长。 缺点：受发酵罐操作容积的限制,3、半连续式发酵,概念 菌体和培养液一起装入发酵罐，在菌体生长过程中，每隔一定时间取出部分发酵培养物，同时补充同等数量的新培养基，然后继续培养，直到发酵结束，取出全部发酵液。 优点： 保持培养液总体积不变，同时可起到解除高浓度基质和产物对发酵的抑制作用。,4、连续式发酵,菌体与培养液一起装入发酵罐，在菌体培养过程中不断补充新培养基，同时取出包括培养液和菌体在内的发酵液，发酵体积和菌体浓度等不变，使菌体处于恒定状态的发酵条件，促进菌体的生长和产物的积累。,连续发酵的控制方式： 恒浊法：利用浊度来检测细胞的生长状况，通过自控仪表调节输入料液流量，以控制培养液中菌体浓度达到恒定值。 恒化器法：通过恒定输入的养料中某一种生长限制基质的浓度来控制。,单级连续发酵,连续发酵达到稳态时放掉发酵液中的细胞量等于生成细胞量。, 多级连续发酵,增加罐的级数和将菌体送回罐内, 连续式发酵优缺点,优点：产率、生产质量、生产能力、生产稳定性、设备利用率和易于实现自动化方面比分批式发酵优越；还可以不断收获产物，提高菌体密度。 缺点：杂菌污染机会增多，细胞易发生变异和退化。,适用范围,生产能力大，微生物变异小，酶活稳定，产品需连续处理的工业体系，仅限用于纯培养要求不高的情况。,第二节 发酵条件的影响及其工艺控制,常规发酵条件：罐温、搅拌转速、搅拌功率、空气流量、罐压、液位、补料、加糖、油或前体等的设定和控制。 能表征过程性质状态的参数：PH值、溶氧、溶解CO2、氧化还原电位、尾气O2和CO2含量、基质或产物浓度、代谢中间体或前体浓度、菌体浓度,一、温度的影响和控制,1、温度对发酵的影响 温度影响微生物发酵化学反应速度 温度影响发酵液的物理性质 温度改变产物合成方向、稳定性 温度选择还应参考其他发酵条件，灵活掌握,2、温度的控制 工业生产上，大发酵罐在发酵过程中一般不需加热，因发酵过程释放了大量发酵热，需冷却的情况较多。,二、PH值的影响和控制,1、PH值对发酵的影响 PH值影响细胞内各种酶的催化活力产生影响。 PH值影响膜电位和细胞跨膜运输 PH值变化导致发酵产物稳定性变化，影响其积累 PH值影响细胞表面电荷，关系到细胞结团或絮凝,2、PH值的控制 发酵过程中的PH值可通过直接补加生理酸性物质或生理碱性物质和补料的方式来控制。 补料方法可以实现补充营养、延长发酵周期、调节PH值和培养液的特性。,三、溶氧的影响和控制,1、溶氧的影响 溶氧直接影响菌体生长 溶氧对产物形成的影响是多样性的,2、溶氧的控制 发酵的溶氧浓度是由供氧和需氧两方面决定的。一般通过搅拌转速或通气量来控制供氧。发酵液的需氧量受菌体浓度、基质的种类和浓度以及培养条件等因素的影响。,四、二氧化碳的影响与控制,1、二氧化碳的影响 二氧化碳直接影响菌体生长 二氧化碳影响产物形成,2、二氧化碳的控制 生产上一般采取调节搅拌速率及通气量的方法控制调节液相中二氧化碳的浓度,五、加料方式的影响和控制,1、加料 方式的影响 加料方式有三种：一次性加料、一次性投入主料中间补料、连续加料。一般普遍使用的是一次性投入主料中间补料。,2、加料方式的控制 补料操作控制系统分为反馈控制和无反馈控制。 利用排气中二氧化碳含量作为反馈控制参数中较常用的间接方法,六、泡沫的影响和控制,1、泡沫对发酵的影响 增加氧在发酵液中的传递 不利于菌体生长 降低了发酵罐的装料系数 增加染菌的机会 降低发酵物产量,2、泡沫的控制 菌体特性、机械消泡、消泡剂消泡,对微生物、人无毒性 对产物提取不产生任何影响 能耐高温灭菌 来源方便、成本低 对氧传质不产生影响 使用、运输过程中无任何危害 低浓度是具有消泡活性 迅速、持久消泡,七、罐压的控制和影响,1、罐压的控制 罐压影响二氧化碳和氧气的溶解度 影响微生物的生长,2、罐压的控制 控制罐压方法一般为调节空气进口阀门或排气出口阀门的开启度，改变进入或排出气体的流量、维持工艺所需的压力。,八、搅拌的影响和控制,搅拌影响气体的传递速度和发酵液混合均匀程度。 反应搅拌的指标有搅拌转速和搅拌功率。,第三节发酵过程的中间分析,代谢参数按性质分： 物理参数：温度、搅拌速度、空气压力、空气流量、溶氧浓度、表观黏度、排气氧（二氧化碳）浓度。 化学参数：基质浓度、（糖、氮、磷）、PH值、产物浓度、核酸量。 生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力,按检测手段分： 直接参数：温度、PH值 间接参数：KL、摄氧率 直接参数： 在线检测参数：温度、PH值、搅拌转速 离线检测参数：残糖、氨基氮、菌体浓度,一、发酵过程的主要分析项目,1、PH值 影响酶催化活性、基质代谢、产物合成、细胞状态、营养状况、供养状况 测定方法：离线精密PH试纸法、PH计法、PH在线电极测定法,2、排气氧、排气二氧化碳和呼吸熵 排气氧反映菌生长的活性； 排气二氧化碳反映微生物代谢的情况； 呼吸熵反映氧的利用状况。,3、糖含量 糖的消耗反映产生菌的生长繁殖情况，反映产物合成的活力。糖含量的测定，可以控制菌体生长速率，可控制补糖来调节PH值，促进产物合成，不至于盲目补糖，造成发酵不正常。 糖含量测定包括总糖和还原糖。,4、氨基氮和氨态氮 通过氨基氮和氨态氮的分析可控制发酵过程，适时采取补氨措施。发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐，否则影响提取过程。,5、磷含量 磷是核酸的组成部分，是高能化合物ATP的组成部分，磷还能促进糖代谢。,6、菌浓度和菌形态 菌浓度和菌形态直接反映菌生长的情况， 菌浓度测定通过有测黏度法、压缩体积法、静置沉降体积法、光密度测定法（分光光度计、光电比色计）,7、产物浓度 产生菌的合成能力和产物积累情况都要通过产物量的测定来了解，产物浓度直接反映了生产的状况，是发酵控制的重要参数。,二、产物量的测定,（一）产物量的特殊表示法 1、抗生素效价 抗生素效价表示抗生素的有效成分的多少，效价大小用单位（U）来表示。 2、酶活力 在25下，在最适的底物浓度、最适的缓冲液离子强度以及最适的PH值条件下，每分钟能转化1mol分子底物的酶量为一个活力单位。,（二）产物量的测定方法,1、化学法 滴定法 比色法 压差法 2、物理法 旋光度 3、生物法 适用于抗生素效价测定，常用于发酵终了产品效价的测定。,第四节 发酵染菌的防止和处理,一、染菌的途径分析 染菌途径： 种子包括进罐前菌种室阶段出问题 培养基的配制和灭菌不彻底 设备上特别是空气除菌不彻底和过程控制操作上的疏漏。,种子带菌的检查可从菌种室保藏的菌种、斜面、摇瓶直到种子罐。 培养基带菌原因如蒸汽压力或灭菌时间不够，培养基配料未混合均匀，存在结块现象，设备未清洗干净，特别是罐冲洗不到的死角处，有结痂而未铲除干净。 设备方面特别是老设备带菌，原因主要是夹层或盘管、轴封和管道渗漏、空气除菌效果差，管道安装不合理，存在死角等。,二、染菌的判断,镜检或无菌试验 状态参数（溶氧变化规律） 发酵液观察,三、防止和处理染菌的方法,防止染菌的关键是加强技术管理、细化各种预防措施、并做到日常化、制度化、规范化。 （一）重视日常工作 检查空气冷却器、空气夹套加热器、分预过滤器的运行情况。 空气除菌过滤器定期灭菌。 观察总蒸汽温度和压力是否对应，保证蒸汽为饱和蒸汽。 定期拆检连消塔、维持罐，检查内件坚固情况，及时清理内垢。检查喷淋冷却管路及无聊管路上相关阀门的泄露情况。,强化菌种保藏管理，严格执行无菌室管理制度。 认真做好罐的清理、冲洗工作，清除死角。 定期进行碱水煮罐。 根据培养基情况选择正确的灭菌形式。 严格按标准操作规程进行灭菌操作，合理控制灭菌指标在规定范围，避免超标。 对发酵辅助设备仪表进行定期保养和检修。,（二）异常情况处理,（1）对染菌罐放罐后的处理 对各阀门打压试漏并拆检相关设备 （2）种子培养期染菌的处理 种子灭菌弃之并对种子罐及管道进行检查灭菌 （3）发酵早期染菌处理 适当改变生长参数，使有利于生产菌而不利于杂菌的生长；依情况而定，重新进行灭菌，再接种。 （4）发酵中后期染菌处理 加入抗生素或杀菌剂,（5）噬菌体污染的防止及处理,并罐法 轮换使用菌种或使用抗性菌株 放罐重消 罐内灭噬菌体法,第八章 几种重要微生物药物的发酵工艺,一、青霉素的发酵工艺 青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉素培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。青霉素类抗生素是-内酰胺类中一大类抗生素的总称。,理化性质,溶解性 吸湿性 稳定性 聚合反应 过敏反应 降解反应 抗菌活性,1、溶解性 青霉素是一种有机酸，易溶于醇、酸、醚、酯类，在水中的溶解度很小，且会迅速丧失其抗菌能力。青霉素的金属盐极易溶于水，几乎不溶于乙醚、氯仿等有机溶剂。 2、吸湿性 结晶的内在质量、晶形和品种均影响吸湿性。青霉素钠盐、胺盐、钾盐的吸湿性依次减小。由于钠盐比钾盐更不易保存，要求包装严密，以免吸湿变质。,3、稳定性 一般青霉素越纯、越干燥、稳定性越强。一般规定有效期为4年。因为青霉素的水溶液很不稳定，一般都用固体保存。 4、降解反应 青霉素分子中最不稳定的部位是-内酰胺环，而其抗菌作用恰恰决定于-内酰胺环的完整。,5、聚合反应 青霉素的水溶液很容易形成聚合物。它们是青霉素过敏反应的主要过敏原之一。 6、过敏反应 青霉素过敏的原因可能是由于蛋白质或多肽等大分子物质与青霉素或其降解产物结合，引起机体的免疫变态反应。包括过敏性休克、药疹、血清病型反应等。若发生过敏反应，应紧急抢救，用人工呼吸、肾上腺素药物。,应用,青霉素不可与同类抗生素连用 青霉素不可与磺胺和四环素联合用药 青霉素不可与氨基糖苷类混合输液,生产工艺,生产孢子制备 发酵 提炼,生产孢子制备,将砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨培养基培养 再移植到大米或小米固体培养基上，25培养7d 干燥、低温保存,发酵,产黄青霉素 斜面孢子 米孢子 种子罐 发酵罐 发酵液 发酵滤液,真空冷冻干燥或液氮保藏孢子,琼脂斜面培养基上25培养7-9d,用斜面孢子悬浮液接种于大米或小米基质上25培养6-7d,用孢子米粒或孢子悬浮液接种，26通气、搅拌培养60-68h,用种子罐按照10%-15%体积接种，在25通气，搅拌补料分批培养200-240h,冷却至5左右、絮凝、过滤,提炼,发酵滤液 一次萃取 一次水提取 二次萃取 脱色液 结晶混悬液 湿晶体 青霉素工业盐,工艺要点,1、发酵温度控制 产黄青霉素生长的最适温度为27-30，而分泌青霉素的适宜温度是20-24，实际生产中采用26-27。为使温度适合于不同发酵阶段的需要，一般采用变温控制。 2、发酵PH控制 青霉素发酵的最适PH值一般控制在PH6.5-7.0，当PH较高时可通过加糖或天然油脂进行控制；当PH较低时可加入碳酸钙；或氨水进行调节。,3、溶氧浓度的控制 青霉素发酵属好氧发酵，故溶氧浓度是影响青霉素产率的一个重要因素。当溶氧浓度低于30%时，青霉素产率急剧下降。,第二节 红霉素的发酵工艺,一、概述 （一）红霉素及其理化性质 红霉素是大环内酯类抗生素。 （二）药理作用及应用范围 红霉素是广谱抗生素，对G+菌作用强，用于治疗腹泻、菌痢、胆结石、胆囊炎、疟疾、绿脓杆菌继发感染、支气管炎、哮喘和脓毒性心内膜炎皆有效。还起到防治心脏病作用。,二、红霉素的发酵工艺过程,（一）菌种 红霉素的产生菌是红色糖多孢菌,（二）发酵工艺流程,沙土孢子 斜面母瓶 斜面子瓶 一级种子罐 二级种子罐（繁殖罐） 发酵罐 放罐,孢子培养37，7-10天,孢子培养37，7-10天,种子培养35，60-70h,种子培养33-35，35-40h,发酵培养31，150-160h,(三)发酵工艺过程,1、生产孢子制备工艺 斜面孢子培养基组分为淀粉、硫酸铵、氯化钠、玉米浆、碳酸钙、琼脂。 2、发酵工艺 红霉素大规模生产一般是将其孢子悬液接入种子罐，种子扩大培养2次后移入发酵罐进行发酵。,（四）发酵工艺控制要点,1、种子质量的控制 成熟的斜面孢子呈深米色，色泽新鲜、均匀、无黑点，背面产生红色或红棕色色素。 2、培养基的控制 碳源 主要以葡萄糖为主，其次为淀粉。生产上一般用母液糖 氮源 以黄豆饼粉为主，其次为玉米浆和硫酸铵 前体 生产上采用发酵过程加入丙酸或丙醇作为前体以提高红霉素A的产量。,3、培养条件的控制 通气和搅拌 1：（0.8-1.2）v/v/m 温度 一般采用全程31培养 PH值 6.6-7.2 中间补料 还原糖控制在1.2-1.5%范围内；有机氮源补加根据发酵液黏度大小决定补入量；前体在24-39h，发酵液变浓、PH值高于6.5时开始补入。 通氨 发酵后期,发酵液黏度的控制 适当提高发酵液黏度，可通过减慢搅拌转速，改变搅拌叶型式、降低罐温、增加有机氮源补量，滴加氨水等实现。 泡沫与消沫 植物油做消沫剂,4、异常情况及处理,（1）停电影响 2h影响发酵单位水平，100h影响发酵液以及成品质量 （2）染菌处理 降温至28培养，并加入洁尔灭 （3）发酵液浓度特别低 加入酵母粉和蛋白胨,第三节 螺旋霉素的发酵工艺,一、概述 1、螺旋霉素及其理化性质 螺旋霉素易溶于有机溶媒，化学性质稳定，是典型的大环内酯类抗生素，产生菌为链霉菌属。 2、药理作用 螺旋霉素经酰化反应合成乙酰螺旋霉素，组织浓度高，毒性低，体内疗效长，具有较强的抗生素后续作用（PAE）对革兰氏阳性菌与奈瑟氏球菌有较好的抗菌作用，口服吸收良好。,二、工艺流程,发酵工艺流程 菌种甘油冷冻管 解冻 一级摇瓶培养26-28，培养24h 二级摇瓶培养26-28，培养24h 一级种子罐培养26-28，培养24h 二级种子罐培养26-28，培养24h 发酵罐发酵生产25-27，培养100h 发酵液放罐,发酵设备流程 菌种甘油冷冻管 一级摇瓶（500mL） 二级摇瓶（500mL） 一级种子罐（500L） 二级种子罐（4000L） 发酵罐（30m3）,三、生产过程,1、菌种 一般选用螺旋霉素链霉菌经多次诱变（紫外光照&光修复）后获得的高产菌种。 2、种子和发酵培养基 3、一级摇瓶菌丝的制备 将保存的冷冻管取出，放置室温或37恒温室化冻后，在无菌条件下吸3.5mL冷冻液接入有75mL培养基的一级摇瓶，27振荡培养24h。,4、二级摇瓶菌丝的制备 将长好的一级摇瓶菌丝在无菌条件下吸3.5mL接入有75mL培养基的二级摇瓶中，27振荡培养24h，得二级摇瓶菌丝。 5、一级种子罐的菌种培养 6、二级种子罐的菌种培养 7、三级种子罐的菌种培养,发酵工艺研究,提高生产水平 1、提高菌种生产能力 2、对生产过程中主要生理参数进行检测 3、提高发酵的设计水平 4、对工艺实行自动化控制,四、发酵工艺控制,1、碳源 以葡萄糖和淀粉为混合碳源时，淀粉比例较大，发酵单位较高。 2、氮源 以鱼粉和黄豆饼粉混合氮源为主。铵盐对螺旋霉素有抑制作用。 3、无机盐 磷酸盐对螺旋霉素发酵过程中起着重要作用。 4、氨基酸 甲硫氨酸对螺旋霉素合成的促进作用最大,提炼,利用游离碱或盐在不同PH值下能溶在不容溶剂中的特性，以醋酸乙酯和酸性水溶液进行萃取，最后转入水相，调PH值至碱性，析出螺旋霉素游离碱，经洗涤干燥后即得成品。 注意：PH值过高或过低均能形成螺旋霉素的降解产物，导致抗菌活性的下降。,第九章 微生物药物的分离与精制,第一节 概述 一、概念 从发酵液、反应液或培养液中分离、精制有关产品的过程，这个过程利用产物和杂质的物理化学性质的不同，提取产物或者从系统中去除杂质的操作。,二、微生物工程下游加工过程的特点,1、起始浓度较低而杂质又较多，最后成品要求达到的纯度又较高，因此常需多步纯化操作。 2、欲提取的生物物质通常不稳定，遇热、极端PH值、有机溶剂会引起失活或分解。 3、发酵或培养都是分批操作，且微生物总有一定的变异性，故各批发酵液不尽相同。,三、微生物工程下游加工的一般过程和单元操作,1、发酵液的预处理和固液分离（凝聚和絮凝） 2、初步纯化（提取：沉淀、吸附、萃取） 3、高度纯化（精制：层析、离子交换） 4、最后纯化（成品加工：浓缩、结晶、干燥）,第二节 发酵液的预处理及固液分离,目的：达到固液分离 根据活性物质的许可范围，可以采取酸化、加热、过滤、絮凝、离心等方法,一、发酵液的预处理,1、高价无机离子的去除 Ca2+ 草酸 Mg2+ 三聚磷酸钠 Fe3+ 黄血盐 普鲁氏蓝沉淀,2、杂蛋白的去除 沉淀法 等电点法：在某一PH下，净电荷为零，溶解度最小 化合沉淀法（如酸性溶液中，蛋白质与三氯乙酸盐、水杨酸盐、过氯酸盐形成沉淀；碱性溶液中，与Ag+、Cu2+、Zn2+形成沉淀） 变性法 热变性：适于热稳定物质 大幅度调节PH：根据产物特性反向调节 加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等,缺点： 加热法只适合于对热较稳定