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基因诊断和基因治疗,南通大学医学院生化教研室,沈 勤,概念：,基因是携带生物遗传信息的基本功能单位，是位于染色体上的一段特定DNA序列。基因的改变，会导致各种表型的改变，进而引起疾病的发生。,将基因或其组成部分发生异常的疾病统 称为基因病。,基因病分为三大类：,一、单基因病： 由单个基因突变引起的一类疾病。 如：血友病、地中海贫血等。,二、多基因病：由多个基因突变综合作用引起的 疾病。如：恶性肿瘤、高血压、动脉硬化、 糖尿病、先天畸形等、,三、获得性基因病：指外源基因（DNA）侵入， 在机体产生疾病，一旦将其清除便可痊愈。 如：艾滋病及各种微生物感染病。,第一节 基因诊断 （DNA diagnosis）,一、基因诊断的概念和基本概况,临床诊断 生化学诊断 免疫学诊断,临床疾病诊断四种方式：,以疾病表型改变为依据。 （细胞形态结构变化、代谢产物异常、特定蛋白分子识别差异等）,基因诊断,对患者基因直接分析,基因诊断定义（概念）：,基因诊断是利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测患者体内基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断或辅助诊断。,基因诊断是在DNA/RNA水平检测分析基因的存在、结构变异和表达状态，与传统诊断方法比较有其特点：,基因诊断的特点：,1、病因诊断：,直接瞄准病理基因，不仅对表型出现的疾病作出诊断，还可能发现 潜在的致病因素，如: 确定有遗传家族史的人携带致病基因。,2、特异性强、灵敏度高：,选用特定基因序列作为探针，单拷贝基因采用高度扩增PCR技术。,3、稳定性高,4、诊断范围广，适应性强,目的基因是否处于活化状态均可。样品可长期保存。,可检测正在生长的病原体或潜在病原体。,（与以疾病表型改变为依据的 诊断技术相比）,基因诊断的基本概况：,伴随分子生物学理论技术的发展而建立和发展。,DNA双螺旋 遗传密码破译 DNA重组 癌基因与抑癌基因研究 地中海贫血病基因治疗和逆转录病毒载体开发 PCR、分子杂交等一系列技术发展,二、基因诊断的对象,1、病原生物的侵入,病原体：病毒、支原体、细菌、寄生虫,检查诊断方法：显微镜、免疫学方法、基因诊断等。,尤其是当无抗体时，基因诊断成为唯一手段。,2、先天遗传性疾病,遗传性疾病: 发病的原因为特定基因的突变。,肿瘤的发生：,发病机理尚不请。 初步认为是个别细胞基因突变而引起的 细胞无限增殖.（包括抑癌基因和癌基因）,3、后天基因突变引起的疾病,二、基因诊断的对象,（1）用核心顺序的串联重复序列组成探针进行杂交研 究，可同时检出具有高度多态性位点。 （2）用southern 杂交得到DNA指纹图谱,个体识别、亲子鉴定、法医物证,4、其他,二、基因诊断的对象,遗传稳定，个体特异，因而用于法医和亲子鉴定。,基因诊断的基本策略：,1、检测已知的能产生某种特定功能蛋白的基因,这些基因根据其特定功能已被克隆，并被定位在染色体上，基因序列亦被测定，致病时的基因改变亦较清楚。,如：已被克隆的病毒、细菌、霉菌和寄生虫的基因、 与致病有关的癌基因、抗癌基因、 地中海贫血、苯丙酮尿症等遗传病基因。,2、检测与某种遗传标志连锁的致病基因,遗传连锁同一染色体相邻的二个或二个以上的基因或限制性酶切位点，由于位置十分靠近，在遗传时分离几率很低，常一起遗传-称连锁。,染色体遗传连锁图用限制性内切酶酶切位点作遗传 标志，定位与之相连锁的正常基因与致病基因，建立相应的遗传连锁图谱。,定位性克隆根据遗传连锁图进行定位性克隆。比较正常 和异常基因的差别，可找出导致遗传病的分子缺陷。 定位性克隆策略是当前基因诊断的重要基础。,3、检测表型克隆基因,针对多基因病（如：重度肥胖、哮喘、高血压、癫痫、精神病、多种自身免疫性疾病）。,表型克隆技术是将有关表型与基因结构结合，直接 分离该表型的相关基因，并对疾病相关的一组基因进行 克隆，然后用作多种探针，来诊断多基因遗传病。,该策略既不需预先知道基因的生化功能或图谱定位，也不受 基因数目及其相互作用方式的影响。,方法：,1、DD-RT-PCR：分析正常和异常基因组 寻找两者之间的差异序列,2、基因组错配筛选技术：寻找两者的全同序列，分离、鉴定与疾病相关的基因，确定导致疾病的分子缺陷,基因诊断的基本步骤：,1、获得待检样品：提取核酸 （PCR提高灵敏度),2、制备和标记核酸探针,3、基因检测分析,三、基因诊断的常用技术,核酸分子杂交 聚合酶链反应（PCR） 限制性片段长度多态性（RELP） 扩增片段长度多态性（AFLP） 等位基因特异的寡核苷酸（ASO） 单链构象多态性（SSCP） 基因芯片,1、核酸分子杂交,原理： 利用核酸的变性、复性及碱基互补的性质，用已知基因的核酸序列作探针，与变性后的单链基因组DNA/RNA杂交，检测核酸样品中是否存在与探针互补的同源核酸序列，进行DNA或RNA定性定量分析。,基因检验的两个必要条件：,1、必需的特异探针（标记的） 2、必需的基因组DNA,核酸分子杂交核酸印迹杂交,DNA印迹杂交（ Southern blot） RNA印迹杂交 （Nouthern blot） 斑点印迹杂交 （Dot-blot） 原位杂交 (situ hybridization),核酸印迹杂交基本过程：,提取DNA或RNA 酶切 凝胶电泳 胶变 性处理（DNA） 转印核酸片段到NC膜上。 （RNA可直接用变性胶电泳，转膜）,1、制备样品：,核酸印迹杂交基本过程：,（2）制备探针：,探针：一段能和待检测核酸分子按碱基互补配对 原则而结合的核酸分子片段。 探针需要标记可直接检测的元素或分子。 如：同位素、荧光、生物素等,核酸印迹杂交基本过程：,核酸印迹杂交可检测pg水平的靶分子,（4）检测： 方法依标记的探针而不同 *放射性同位素 *生物素 *地高辛 *荧光素,（3）杂交： 预杂交封闭非特异性结合位点 杂交探针与核酸分子结合,核酸印迹杂交基本过程：,2、聚合酶链反应（PCR),原理：,以待扩增DNA为模板，在互补模板两端序列的寡核苷酸引物介导下，通过耐高温DNA聚合酶催化下，按半保留复制机制延模板链延伸，快速、特异地扩增特定的DNA。,一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术。 （无细胞分子克隆技术）。,耐高温DNA聚合酶Taq酶,寡核苷酸引物：设计引物和确定退火温度是PCR 成功的关键。,PCR的基本过程：（循环程序）,变性（95） 退火（5565 ） 延伸（72 ）,35分,401分,100bp/1分,源自水栖高温菌，最适反应温度为72，且经 90以上加温后仍可在温度恢复后复性。,（呈2n 扩增速度）,PCR基本过程和原理,特点：特异性强 灵敏度高 样品可以是： 毛发、血痕 单细胞、 病原体、 肿瘤残留物、 犯罪现场遗留物,基因诊断中常用的PCR技术：,（1）、DNA PCR：,（2）、RT- PCR：,以DNA为模板，扩增特定核苷酸序列。用于检测特 定基因片段的存在，分析鉴定基因突变。,以总RNA或mRNA为模板，逆转录为cDNA后扩增。用 于检测特定基因表达水平的主要方法之一。,（3）、PCR-SSCP：,检测基因未知突变的常用技术。简单、快捷、灵敏。,（4）、多重 PCR：,指在一次PCR反应中加入多对引物，同时扩增DNA 序列上不同序列片段的一种PCR技术。用于一些“超大” 基因中大片段缺失分析。,（5）、原位 PCR：,直接用组织切片和细胞进行PCR或RT-PCR，在组织、 细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特点基因序列。,（6）、实时定量 PCR：,借助特异性结合DNA的荧光染料，实时动态检测PCR 扩增的DNA量的变化。,其他重要的PCR衍生技术,反向PCR（IPCR） 标记引物PCR（labelled primers PCR） 锚定PCR（anchored PCR） 差异展示PCR（DD-PCR）,（见书“分子生物学技术”章节）,3、限制性片段长度多态性（RFLP）,检出方法： Southern 印迹,概念：,用同一限制性内切酶完全切割同一物种的不同个体的基因组DNA，出现分子质量不同的同源片段，这种由限制性内切酶酶切位点变化导致的DNA片段差异，称限制性片段长度多态性（RFLP）。,人类基因组中由中性突变导致个体间核苷酸 的差异称DNA多态性,RFLP类型：,2、由于链内发生较大片段的缺失、重复、插入和重 排导致DNA顺序的变化，因而酶切片段改变 序列多态性。,1、单个碱基的突变引起酶切位点的变化 点多态性,致病基因附近或内部一般存在RFLP,可用于连锁 分析的基因诊断。,（四）扩增片段长度多态性（AFLP）,应用于基因突变性质不明的连锁分析。,AFLP串联重复的短片段的长度多态性通过PCR扩增,经限制性内切酶酶切后电泳,产生显示扩增片段多态性。,AFLP原理：,首先利用可产生粘性末端的限制性内切酶酶切研究对象的基因组序列，产生不同长度的酶切片段。然后，将这些酶切片段与含有与其有共同粘性末段的人工接头连接，形成模板。为达到选择性扩增的目的，再在模板末端添加具有选择性核苷酸（13个）的不同引物，然后PCR扩增，结果只有那些两端序列与选择性核苷酸配对的酶切片段被扩增。最后将被扩增的片段在高分辨率的测序凝胶上电泳，这样其多态性即根据扩增片段的长度与数量的不同而被分开。,PCR扩增产物即等位片段之间 差别只有几个bp。,5、等位基因特异的寡核苷酸（ASO）,方法：,1、合成两种探针： 已知突变位点的核苷酸序列（M） 正常基因碱基序列（N）,2、杂交实验结果：,M+ N- 受检者是突变基因的纯合子,M- N+ 受检者是不存在突变基因,M- N- 受检者的缺陷基因可能是一种新的突变类型,M+ N+ 受检者是突变基因的杂合子,原理： 已知基因突变部位和性质，合成基因特异的核苷酸探针（20bp），标记后与受检者DNA杂交诊断。（可与 PCR联用：PCR-ASO）,6、单链构象多态性（SSCP）,日本Orita等研究发现，单链DNA片段呈复杂的 空间折叠构象，当有一个碱基发生改变时，会或 多或 少地影响其空间构象，使构象发生改变， 空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺 凝胶中受排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙 烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常 敏锐地将构 象上有差异的分子分离开.,PCR-SSCP,PCR-SSCP基本过程,PCR扩增靶DNA 将特异的PCR扩增产物变性后快速复性; 将单 链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳; 通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显 色分析结果.若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变.,7、基因芯片,将指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测根据杂交分子和未杂交分子信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。,基本原理：,（生物集成模片、DNA阵列、或寡核苷酸微芯片）,基因芯片技术：,目的：检测外源性基因的侵入,目标：,1、微生物 2、病毒 如： HIV（致艾滋病 AIDS） 3、寄生虫、 4、不易体外培养的病原体（毒性大肠杆菌、麻风分枝 杆菌） 5、实验室培养的病原体（克立氏体）,四、基因诊断的 临床应用:,1、在感染性疾病检测中应用,艾滋病与HIV病毒,艾滋病由HIV通过接触、血液、血制品及母婴传播感染所致。HIV特异地侵犯辅助性T细胞（CD4），引起人体细胞免疫严重缺陷，导致顽固的机会性感染，恶性肿瘤和神经系统损伤。 HIV 感染后，95%感染者5个月可检出抗体（也有3-4年仍不能检出抗体）。有必要进行PCR技术检测。,艾滋病与HIV病毒,检测技术：巢式-PCR、Southern、DNA序列分析,引物的设计：应在保守区（基因：pol, env, gag, tat),病毒特点：,HIV病毒由两条单链RNA组成，9.7k / RNA， 主要基因结构和组成形成与其他逆转录病毒相同，但较 之复杂，故称复杂反转录病毒,HIV属反转录病毒即单链RNA反转录成双链DNA， 进入宿主细胞染色体。,非典型性肺炎（SARS）,由一种新型冠状病毒（SARS-CoV）引起，多种 途径传播，传染性强、高致死率的急性疾病。,诊断依靠： 流行病学、临床表现、放射诊断、 血清学（荧光免疫、ELISA）,PCR作为一种灵敏的早期病原学诊断必不可少 （关键是引物的合成）,2、在遗传病检测中的应用,产前诊断 检测妊娠812周的绒毛DNA或羊水细胞 PCR诊断一系列遗传疾病,镰刀状细胞贫血的诊断 方法：RFLP诊断 Mst酶切识别序列：CCTNAGG 切割正常链序列：CCTGAGG 不切割突变序列：CCTGTGG ASO探针诊断,3、在肿瘤检测中的应用,原癌基因 生物正常细胞基因中编码关键性调控蛋白的 癌基因,抑癌基因 一类抑制细胞增殖的基因，其失活可引起细 胞转化。,两类基因协同调控，使细胞生长处于平衡状态。,癌基因激活变化及检测：,1、基因扩增：即染色体某区段基因拷贝数增加，或癌基 因的扩增。,检测方法： Southern 杂交 定量PCR,2、基因的过量表达：包括基因扩增基础上的过量表达及非 DNA水平的过量表达。,检测方法： Northern 杂交 RT-PCR,3、点突变： 检测方法为各种基于PCR的方法。,抑癌基因的检测：Southern PCR,大片段的缺失、和点突变,*两个等位抑癌基因突变才能引起肿瘤，需检 出两个等位抑癌基因。,方法：RFLP结合PCR，进行缺失检测 点突变主要采用PCR,肿瘤标志物：指特征性存在于恶性肿瘤或由恶性肿瘤细 胞异常产生的物质或宿主对肿瘤反应而产 生的物质。,（1）酶类肿瘤标志物,（2）激素类标志物,（3）胚胎抗原,（4）特殊蛋白标志物,（5）糖蛋白类抗原,（6）血中癌基因蛋白,（7）唾液酸和唾液酸酰基转移酶,（8）多胺,免疫组化筛选提高检出率,法医学鉴定,针对人类DNA 遗传差异进行的个体识别和亲子鉴定。,常用技术:,DNA指纹分析（VNTR） 短串联重复序列（STR）遗传特征分析 PCR-扩增片段长度多态性（AmP-FLP) PCR-mtDNA技术,根据可变串联重复序列（小卫星DNA）多态性 高度的个体特异性,DNA指纹（图谱）分析：,、选择核心序列作探针，选在核心序列上无切割 位点的限制性内切酶，酶解样品， Southern blot得到DNA指纹图谱。,针对可变串联重复序列（VNTR） （VNTR是判断个体的遗传标志）,、针对VNTR侧翼保守区序列设计探针，用PCR 对该区扩增，电泳得到个体之间长度不同的条 带图谱。（VNTR片段较长PCR不易扩增）。,第二节 基因治疗（gene therapuy),概念：,将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因缺陷和异常基因引起的疾病，达到治疗目的。,导入的基因可以与缺陷基因对应、在体内表达具有特异功能的同源基因、也可以是与缺陷基因无关的治疗基因。,概念的扩展：,凡是采用分子生物学方法原理，将某种遗传物质转移 到患者细胞内，使其在体内发挥作用，达到治疗目的 的方法，都可称为基因治疗。,基因治疗策略:,总原则：,直接补替缺陷基因 抑制非正常基因产物表达 间接调节机体本身免疫系统的抗病能力。 利用外源基因对病变细胞造成特异性杀伤,1、基因矫正将致病基因的碱基进行纠正，而正常部分予以保留。,2、基因置换用正常基因通过体内基因同源重组，原位置换病变细 胞内的致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常,3、基因增补将目的基因导入病变细胞或其它细胞，不去除异常 基因，而是通过目的基因的非定点整合，使其表达 产物补偿缺陷基因的功能或使原有功能得以加强。,4、基因失活利用反义技术特异封闭基因表达，抑制有害基因 的表达。,5、免疫调节将抗体、抗原或细胞因子的基因导入病人体内， 改变病人免疫状态，达到预防和治疗的目的。,基因治疗的策略：,6、调节性基因治疗： 导入编码调控蛋白的基因，治疗 基因表答异常的疾病,7、化疗保护性基因治疗： 导入单相或多相细胞毒性药 物的抗性基因，使正常细胞耐受化疗药物的能力大 大提高。,8、特异性细胞杀伤性基因治疗：利用DNA重组技术构建 特异性杀伤靶细胞为目标的“奇异弹头”，“弹头”部分是 分子重组的各种生物细胞毒素，它们以酶催化方式发挥 抑制蛋白合成作用，造成细胞杀伤。,9、生殖细胞基因治疗：生殖细胞或胚胎干细胞补偿性治疗,基因治疗基本程序;,方法：,1、体外法 （ex vivo):,2、体内法 (in vivo):,将受体细胞在体外培养，转入外源基因，经适当选择系统，将重组的受体细 胞回输患者体内，以改善症状。（普遍采用）,直接将外源基因导入体内有关的组织器官,使其进入相应的细胞并转录、表达而发挥治疗作用。,基本程序：,选择目的基因,选择基因载体,选择靶细胞,基因转移,外源基因表达及检测,回输体内,治疗基因的来源：,1、野生型基因： -单基因缺陷遗传病基因 -反义核酸封闭活化的原癌基因 -转入相关的抑癌基因，抑制肿瘤,2、重组DNA和分子克隆技术，人工合成特异 基因。,1、选择治疗的目的基因,用于基因治疗的基因应满足以下条件：,（1）体内仅少量表达就可显著改善症状。 （2）该基因的过量表达不会对机体造成危害、 （3）在抗病毒和抗病原体的基因治疗中，所选 择的靶基因应在病毒和病原体的生活史中 起重要作用，并且该序列是特异的。,理想的载体具有以下特征：,1、容易生产- 商业化生产，广泛应用，易运输，易保存,2、持续表达- 一旦转入体内，应能在一定时间内持续表达基因产 物，或能通过某种方法精细调节其表达。,3、弱免疫源- 转入后不应引起免疫反应。,4、组织靶向性- 定向输入某种细胞。,5、包装容量载体对转染基因的大小应没有限制。,6、复制、分裂和整合能力：特异性定位整合，或以游离基因形式 存在于细胞核内。,7、能感染分裂期细胞和未分裂期细胞,2、选择基因载体：,基因载体：,非病毒载体 （裸DNA、脂质体）,病毒载体 （反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒）,分类：,优点： 大量生产，毒性小，低免疫性 缺点：效率低。,优点：多数病毒可感染特异细胞，不易降解， RNA病毒能整合到宿主染色体，表达 水平高等。,病毒介导的基因转移,1、逆转录病毒：正链RNA病毒,逆转录病毒结构:,基因组组成：,（1）5帽子；3尾巴；,（2） 每个单链RNA含6个区： 5-LTR（长末端重复序列） + （组装所需的非编码序列） gag（编码衣壳结构蛋白基因） pol（编码反转录酶基因） env（编码外壳蛋白基因） 3-LTR,逆转录病毒生活周期:,1、感染靶细胞,2、利用自身编码的逆反转录酶，以RNA为模板合成DNA。,3、将病毒DNA转运至宿主细胞核,4、病毒DNA整合到宿主染色体,5、以病毒DNA为模板转录RNA,6、在细胞中翻译Gag、Pol和Env蛋白,7、形成衣壳，RNA单链和反转录酶一起包装进衣壳。,8、形成病毒颗粒并分泌到胞外。,逆转录病毒,病毒RNA,宿主细胞,RT,RT,逆转录酶,cDNA,双链,插入,基因组DNA,逆转录病毒感染过程,病毒RNA,构建逆转录病毒载体：,（1）构建重组野生性病毒：插入相关外源基因，改造成DNA载体（包括插入选择性标记），替代病毒的编码基因。 （2）制备辅助细胞（293T细胞），为载体DNA提供其丧失的功能。 （3）载体DNA导入辅助细胞，产生病毒载体。 （4）用病毒载体感染细胞，外源基因在宿主细胞中表达。,逆转录病毒载体的缺陷：,1、只能转染处于增殖状态的细胞,2、所携带的外源基因不能太大。,3、感染依赖靶细胞表面受体的限制,4、理论上不扩散其它细胞，但某些情况会造成 野生型病毒爆发。,5、有致细胞癌变的可能。,6、逆转录病毒不能耐受纯化和浓缩过程。,腺相关病毒(AVV ),一种小的、非致病的、单链DNA病毒。是从属病毒，需 要其他基因才能复制。,结构： rep基因编码病毒的复制、整合功能所需蛋白 cap基因编码病毒结构组分 ITRs序列反向末端重复，定义基因的开始和 结束，制约DNA序列大小，包裹入 衣壳。,细胞对AVV病毒的亲和力高，AVV载体适用范围广泛。,骨髓细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞、肌细胞,选择原则:,1、较坚固，耐受处理，易于由人体分离，便于输 回体内。 2、具有增殖优势，生命周期长，能存活几个月或几年， 至病人的整个生命。 3、易于受外源遗传物质的转化。 4、在选用病毒载体时，目的基因具表达最好具有组织特异 性的细胞,3、选择靶细胞,（禁止使用生殖细胞，只能用体细胞）,1、骨髓细胞：最被重视和常用的靶细胞。,常用细胞：,优点：易接受各种处理、已积累丰富经验，多数遗传疾病 涉及骨髓细胞、源自骨髓的细胞遍布全身。,缺点： -骨髓干细胞含量少（占骨髓细胞0.1%） -治疗基因在核骨髓细胞表达时间短（几个月）。 -只有部分干细胞有活性 -造血干细胞分化可能导致基因失活。 -有些遗传疾病与骨髓干细胞无关。,2、肝细胞：是许多遗传代谢缺陷的靶细胞。,3、皮肤细胞：易于繁殖及转化。,4、淋巴细胞：易采集、分离，大量繁殖，连续 多次输入,5、癌细胞：肿瘤治疗常用细胞。,方法：,1、物理法：,显微注射法 电穿孔法 基因枪技术,2、化学法：,磷酸钙沉淀法 DEAE-葡萄糖法 脂质体法,3、融合法,4、病毒感染法,4、基因的转移,转染细胞后的筛选：,方法：,1、标记基因筛选法： 2、基因缺陷型受体细胞的选择性 3、基因共转染技术 4、分子生物学方法:,原位杂交 Southern杂交 斑点杂交,方法： （目的基因和标记基因的表达）,原位杂交、 Nouthern杂交、 RNA点杂交 （检测mRNA的转录） 免疫组化染色（检测基因翻译出的蛋白质),5、外源基因表达的检测：,6、回输体内,将治疗性基因修饰的细胞通过不同方式回输 入体内，以发挥治疗效果。,如： -淋巴细胞经静脉回输入血 -造血细胞经自体骨髓移植 - 皮肤成纤维细胞经胶原包裹后埋入皮下组织,1、肝专一性表达： 磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶启动子,2、肌肉专一性表达：肌苷激酶的调控片段,3、乳腺专一性表达： 酪蛋白，乳清酸蛋白,4、黑色素专一性表达: 酪氨酸和酪氨酸相关蛋白（TRP),5、胶质瘤专一性表达：鞘磷酸碱性蛋白基因上游片段,6、肺癌专一性表达： 人表面活性蛋白A,与目的基因一起重组入反转录病毒，用于基因靶向表达。,组织专一性表达的调节片段:,基因治疗的应用及展望,应用治疗：,遗传病（学友病、囊性纤维病、家族性高血压 恶性肿瘤 心血管疾病 感染性疾病（AIDS、类风湿等）,呈待解决的问题：,外源基因表达效率 外源基因表达调控 遗传性疾病面临的免疫问题 反转录病毒载体随机插入的外源基因，若插入不当，可能破坏另一个基因的表达或激活其它基因（潜在的危险）。,使用巢式引物进行连续多轮扩增可以提高特异性和灵敏度。第一轮是15 到20 个循环的标准扩增。将一小部分起始扩增产物稀释100 到1000 倍加入到第二轮扩增中进行15 到20个循环。或者，也可以通过凝胶纯化将起始扩增产物进行大小选择。在第二轮扩增中使用一套巢式引物，其可以同第一套引物内侧的靶序列结合。巢式PCR 的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同两套引物都互补的靶序列很少。而使用同样的引物对进行总数相同的循环（30 到40）会扩增非特异性靶位点。巢式PCR 可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5 RACE）的特异性。,巢式PCR,