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2019-2020年高三生物总复习 第40讲 微生物的利用教案【考纲要求】 微生物的利用 考纲要求具体内容(1)进行微生物的分离和培养(2)测定某种微生物的数量(3)研究培养基对微生物的选择作用(4)探讨微生物的利用 实验内容(1)培养基的配制(2)高压蒸汽灭菌和干热灭菌(3)倒平板操作(4)平板划线操作和稀释涂布平板法(5)应用选择培养基分离某种特定的微生物 实验与探究能力【考点分析】考点试卷类型分值题型(1)进行微生物的分离和培养(2)测定某种微生物的数量(3)研究培养基对微生物的选择作用(4)探讨微生物的利用(1)培养基的配制(2)高压蒸汽灭菌和干热灭菌(3)倒平板操作(4)平板划线操作和稀释涂布平板法(5)应用选择培养基分离某种特定的微生物xx 宁夏15非选择题xx 江苏2选择题xx 山东8非选择题xx 江苏3选择题xx 广东15非选择题xx 宁夏15非选择题xx 广东10非选择题xx 广东10非选择题xx 广东10非选择题xx 辽宁、宁夏15非选择题xx 上海9非选择题【考点预测】从近几年高考试题看，微生物的营养、培养基的种类和配制、进行微生物的培养与分离等内容是命题的素材。培养基的种类与配制是本模块的重点内容，今年高考命题可能会从下面三个方面展开： 1培养基及其无菌技术 2应用选择培养基分离某种特定的微生物 3有关的实验原理、方法、步骤和预测 本专题内容侧重考查学生的实际应用能力，由于很多课题的开展具有一定的难度，从考试的角度上讲也很难实现动手能力的考查。从近几年掰课标地区生物试题看注重考查基础知识，同时进行简单应用的考查。考查知识点分布主要集中在微生物的营养、培养基种类和配制、程序及其注意事项、无菌技术、微生物的选择和鉴别培养等。以非选择题为主，为选做题之一。【知识梳理】一、 微生物的实验室培养1、培养基2、无菌技术3、试验操作二、土壤中分解尿素的细菌分离与计数1、试验设计2、设置对照3、筛选菌株三、分解纤维素的微生物的分离1、纤维素2、试验设计【重点解析】微生物的实验室培养1、 微生物的营养物质及功能 碳源 氮源 生长因子 水无机拦概念凡能为微生物提供所需碳元素的营养物质凡能为微生物提供所需氮元素的营养物质微生物生长不可缺少的微量有机物来源无机碳源：C02、NaHC03等；有机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等无机氮源：N2、氨、铵盐、硝酸盐等；有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等酵母膏、蛋白胨、动植物组织提取液作用 主要用于构成微生物的细胞物质和一些代谢产物；异养微生物的主要能源物质主要用于合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物酶和核酸的组成成分溶剂、生化反应的介质酶的成分、调节渗透压等说明不同种类的微生物，对碳源的需要差别较大。例：甲基营养菌只利用甲醇、甲烷；假单胞菌利用90多种含碳化合物对于异养微生物，含C、H、0、N的化合物既是碳源，又是氮源微生物需要补充生长因子是由于缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限2、 培养基的种类划分标准培养基种类特点用途按物理性质 液体培养基不加凝固剂工业生产固体培养基加凝固剂，(如琼脂)微生物分离、鉴定，活菌计数，保藏菌种按用途选择培养基培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长培养、分离出特定微生物如培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素；培养金黄色葡萄球菌，可在培养基中加入高浓度食盐鉴别培养基根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物，如可用伊红一美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽) 3、 无菌技术消毒与灭菌 概念 常用方法 应用的范围消毒使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法：在100煮沸56 min一般物品巴氏消毒法：7075煮30 min或在80煮15min对于一些不耐高温的液体，如牛奶化学药剂消毒法如用体积分数7075的酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等紫外线消毒：30 W紫外灯照射30 min接种室空气灭菌使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物(包括芽孢和孢子)灼烧灭菌：酒精灯火焰接种工具的灭菌干热灭菌：160l70下灭菌12 h玻璃器皿、金属工具的灭菌高压蒸汽灭菌：121100 kPa条件下，灭菌1530 min培养基及容器的灭菌4制备牛肉膏蛋白胨固体培养基操作分析 (1)培养基需冷却至50时开始倒平板 原因：琼脂是一种多糖，在98以上熔化，在44以下凝固，倒平板时高于50则会烫手，低于50时若不能及时操作，琼脂就会凝固。 估计培养基温度的方法是：培养基从灭菌锅中取出冷却一段时间后用手触摸，感觉上以刚不烫手为准。 (2)平板倒置原因：平板皿盖上会凝结水珠，培养基表面的温度也较高，平板倒置后，既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止肛盖上的水珠落入培养基，造成污染。5纯化大肠杆菌操作过程中的注意事项 微生物的接种方法中最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。 (1)平板划线法 操作第一步即取菌种之前及每次划线之前接种环都需要进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧目的如下表：第一次操作 每次划线之前 划线结束目的杀死接种环上原有的微生物杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者从第二次以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。(2)稀释涂布平板法 稀释涂布平板的操作比较复杂，且各个细节均需保证“无菌”应特别注意： 酒精灯与培养皿的距离要合适。 吸管头不要接触任何其他物体。吸管要在酒精灯火焰周围使用。例1某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验。实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察计数。请回答与此实验相关的问题。 (1)培养基中含有蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供了 和 。除此之外，培养基还必须含有的基本：成分是 和 。 (2)对培养基进行灭菌，应该采用的方法是 。 (3)为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于 中培养，培养的温度设定在37 。要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种 作为对照进行实验。 (4)培养20小时后，观察到平板上有形态和颜色不同的菌落，这说明湖水样品中 种细菌。一般说来，菌落总数越多，湖水遭受细菌污染的程度越 。 (5)如果提高培养基中NaCl的浓度，可以用于筛选耐 细菌，这种培养基被称为 。解析：(1)蛋白胨主要是为细菌提供氮源，淀粉只能为细茵提供碳源，其实，两者还都能为细菌提供能源。虽然各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。(2)培养基常用高压蒸汽灭菌，接种环等用灼烧灭茵，玻璃器皿等适于用干热灭菌。(3)适宜的温度条件下微生物繁殖速度快，恒温箱可通过设定维持适宜的温度；对照组应接种不含细菌的样品，比如接种无菌水。(4)每一种类型的菌落就表示有一种类型的细菌。茵落总数与湖水遭受细菌污染的程度呈正相关。(5)加入NaCl可制作筛选耐盐细菌的选择培养基。蛋白质中含有氮元素和碳元素，为细菌的生长提供了氮源和碳源，而淀粉只能提供碳源。培养基一般采用高压蒸汽进行灭茵。不同的微生物形成的茵落不同，有多种茵落即有多种细菌；污染越重，茵落总数就越多。耐盐细茵可以在高浓度的NaCl培养基中生存，而其他的细菌则很难生存。答案：(1)氮源(碳源不作要求) 碳源 无机盐 水(2)高压蒸汽灭菌 (3)恒温培养箱无菌水 (4)多高 (5)盐(或NaCl)选择性培养基例2苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选出只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，为土壤样品。请问答下列问题： (1)中培养目的菌株的选择培养基中应加入 作为碳源，中不同浓度碳源的培养基 (A影响；B不影响)细菌的数量，如果要测定中活细菌数量，常采用 法。(2)为对照，微生物在中不生长，在中生长，与培养基的主要区别在于 使用 法可以在上获得单菌落。采用固体平板培养细菌时为什么进行倒置培养? (3)如何比较不同菌株降解苯酚能力的大小?(4)实验过程中如何防止其他微生物的污染？解析：本题以实验材料作为背景考查微生物培养及相关实验分析和设计能力等。根据实验目的知，从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，说明苯酚是该种细菌的碳源。如何比较不同菌株降解苯酚能力的大小?该问中应注意自变量为不同菌株，苯酚的浓度是无关变量。由于苯酚显酸性，不同菌株的菌种降解苯酚的能力不同，pH值会不同。可考虑用pH试纸来检测作为因变量。实验中为防止微生物污染，应从制备培养基到接种与培养等全部实验过程保持无菌操作，如用于微生物培养的器皿、接种工具和培养基等进行灭菌等。答案：(1)苯酚A影响稀释涂布平板法。 (2)的培养基没有加入苯酚作为碳源，培养基中加入苯酚作为碳源稀释涂布平板法或平板划线法 以防止培养基冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基。(3)5支洁净培养瓶一分别加入相同培养基(加等量的苯酚，用pH试纸检测这5支瓶内培养基的pH值，用苯酚调试使它们的pH值相等，苯酚是唯一的碳源)一分别接种5种等量的来自不同菌株的菌种一在相同的适宜条件下培养相同的时间一再用pH试纸检测这5支瓶内培养基的pH值。苯酚显酸性，不同菌株的菌种降解苯酚的能力不同，5支；瓶内培养基中的苯酚被分解的量不同，所以pH值不同。用pH试纸检测这5支瓶内培养基的pH值，从而比较不同菌株降解苯酚能力的大小。 (4)从制备培养基到接种与培养等全部实验过程保持无菌操作：a对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。b将用于微生物培养的器皿、接种工具和培养基等进行灭菌。c实验操作应在酒精灯的火焰附近进行。d实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。【实战训练】 材料：饲料原料中的磷元素有相当一部分存在于植酸中，猪、禽等动物由于缺乏有关酶，无法有效利用植酸，造成磷源浪费，而且植酸随粪便排除后易造成环境有机磷污染。植酸酶能催化植酸水解成肌醇和磷酸，因此成为目前重要的饲料添加剂之一。（09广东卷）1.（10分）生物技术实践（1）商品化植酸酶主要来自微生物。在产酶菌株筛选过程中，常在基本培养基中添加不溶于水的植酸钙制成固体平板，植酸钙被植酸酶分解后可在平板上产生 ，可根据其大小选择目的菌株，所得菌株需要进一步测定植酸酶活性。活性测定可以植酸钠作为底物，活性可用一定条件下单位时间 表示。（2）利用上述所得菌株制备植酸酶的流程如下图：中的主要成分为 ；中包含多种酸酶等多种蛋白质。请写出一种纯化得到植酸酶的方法及其依据。（3）为建设基因工程菌，可用PCR等技术从上述菌株中克隆植酸酶基因。PCR反应包含多次循环，每次循环包括三步： 。反应过程中打开模板DNA双链的方法是 。（4）除植酸酶外，微生物还应用在 的生产中。答案：（1）透明圈 植酸钠的消耗量（肌醇和磷酸的生成量）（2）小分子杂质 凝胶色谱法：根据蛋白质之间分子大小，吸附性质等差异进行纯化。（或电泳法：根据蛋白质之间电荷，分子大小等差异进行纯化。）（3）变性，复性，和延伸 加热（4）蛋白酶，脂肪酶，纤维素酶解析：本题考查对微生物的分离和培养，蛋白质的纯化，酶活性鉴定等知识，结合实际应用。（09辽宁、宁夏卷）2.【生物选修1生物技术实践】（15分）（1）在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑_、_和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、_、_等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。（2）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行_（消毒、灭菌）；操作者的双手需要进行清洗和_；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能_。（3）若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的_。（4）通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的_。（5）培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是_。（6）若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过_处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。答案：（1）温度 酸碱度 易培养 生活周期短（2）灭菌 消毒 损伤DNA的结构（3）比例合适（4）鉴定(或分类)（5）将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生.（6）灭菌解析：（1）大肠杆菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、易培养、生活周期短等优点，培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑温度、酸碱度和渗透压等条件。（2）灭菌使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，所以对培养基和培养皿进行灭菌，消毒使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物，操作者的双手需要进行清洗和消毒， 紫外线能使蛋白质变性，还能损伤DNA的结构。（3）稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养，应保证样品稀释的比例适合。（4）对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的鉴定。（5）培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生。（6）因为有的大肠杆菌会释放一种强烈的毒素，并可能导致肠管出现严重症状，使用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。（09上海卷）3 .（9分）氯苯化合物是重要的有机化工原料，原因不易降解，会污染环境。某研究小组依照下列实验方案（图1）筛选出能高效降解氯苯的微生物SP1菌，培养基配方如表1。（1）配制号固体培养基时，除添加号液体培养基成分外，还应添加1%的_。（2）培养基配制时，灭菌与调PH的先后顺序是_。（3）从用途上来说，号培养基和号培养基分别属于_培养基和_培养基。在号培养基中，为SP1菌提供氮源的成分是_。（4）在营养缺乏或环境恶劣时，SP1的菌体会变成一个圆形的休眠体，这种休眠体被称为_。（5）将SP1菌接种在含不同浓度氯苯的号培养液中培养，得到生长曲线（如图2）。从图2可知SP1菌在_培养条件下最早停止生长，其原因是_。答案：（1）琼脂（2）先调PH，后灭菌（3）通用 选择 硝酸铵（4）芽孢（5）20mg/L氯苯 硝酸最早耗尽解析：本题主要考查微生物相关知识。（1）固体培养基必须含有适量的琼脂；（2）配置培养基时应先调PH后灭菌；（3）号培养基是为了获得更多的菌株，属于通用培养基，号培养基是为选择出SP1菌株属于选择培养基，号培养基成分中含N物质为硝酸铵，则应由它为SP1菌株提供氮源；（4）在恶劣环境下一些菌体会形成芽孢休眠体，来度过不良环境；（5）SP1菌株是以氯苯为碳源，当氯苯消耗尽菌株因缺少碳源而不能继续生存，故氯苯含量越少，SP1菌株越早停止生长。【名师点拨】1无菌技术及其常用的方法 灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。 常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌、紫外线灭菌法等 在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环，因为操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。 划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线，以免接种环温度太高，杀死菌种。2.微生物的纯化培养的两种方法：平板划线法和稀释涂布平板法 (1)平板划线法 在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环，在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环。在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线，以免接种环温度太高，杀死菌种。由于划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 (2)稀释涂布平板法 涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。每一个稀释度下涂布三个平板作为重复组，不同稀释度下涂布的平板形成对照组，且每个平板所用的样液不超过01毫升。统计实验结果时注意选取菌落数介于30300个之间的平板进行计数，且重复组结果要有相近性。