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肠杆菌科细菌鉴定,1,实验目的,掌握肠杆菌科细菌的基本特征和鉴定程序 掌握肠杆菌科细菌分类的鉴别试验,2,菌种,埃希氏菌属：大肠 志贺氏菌属：福氏，宋内氏 变形杆菌属：普通变形 克雷伯菌属：肺炎 沙门氏菌属：伤寒、PA，PB,3,肠杆菌鉴定程序,4,实验内容,按检验程序操作（每人一种菌，8人一组）： 1、制作SS平板培养基(成分,原理见下一页) 2、在SS平板上分离接种各菌(大:红色菌落;其它为无色透明) 3、接种肠杆菌科生化：KIA，半固体（M），蛋白胨水（I），尿素（U），葡胨水（Mr），枸橼酸盐培养基（C），苯丙氨酸培养基 4、做GS染色,5,SS平板培养基:选择性培养基,有促进目的菌生长的物质和鉴别用指示剂. 1煌绿、胆盐、硫代硫酸钠、枸橼酸钠等能抑制G+菌及大多数大肠生长，胆盐促进伤寒生长。 2大肠分解乳糖产酸：中性红（6.8红8.0黄 ）变红，与胆盐结合合成胆酸，因而形成中心混浊的深红色菌落，病原菌不分解乳糖，故菌落呈透明微黄色。 3枸橼酸铁能指示硫化氢产生，硫化铁呈黑色 4硫代硫酸钠有缓和胆盐对志贺、沙门菌的毒害作用，并中和煌绿、中性红染料的毒性，使大肠红色鲜明,6,动力试验： 原理：有动力的细菌在半固体培养基中沿穿刺线扩散生长。 培养基：半固体培养 方法：分别穿刺接种大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，37 孵育16-18h 结果：穿刺线扩散，培养基透明度减低为动力阳性；穿刺线清晰，培养基透明为动力阴性。大肠+，肺杆-。,7,吲哚试验：（靛基质试验） 原理：有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，与对二甲基氨基苯甲醛形成红色化合物。 培养基：蛋白胨水 方法：将大肠埃希菌和伤寒沙门菌分别接种于蛋白胨水培养基中，37 孵育16-18h 结果：取出后，滴加吲哚试剂2d，混匀，可见培养物上层呈玫瑰红色为+，不变色为- 大肠+，伤寒-,8,尿素酶试验： 原理：产生尿素酶的细菌能分解尿素，形成氨，使培养基呈碱性，酚红指示剂变成红色。 培养基：尿素培养基 方法：将大肠埃希菌和变形杆菌分别接种于尿素培养基中，37 孵育16-18h 结果：培养基变红色者为阳性。变黄为阴性。 大肠-，变形+,9,甲基红试验： 原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解为甲酸、乙酸等，故培养物pH在4.5以下，加入甲基红指示剂后呈红色。有些细菌分解葡萄糖产生的酸进一步转化为其它物质，如醇、酮等，培养基pH在6.2以上，加入甲基红指示剂呈黄色。 培养基：葡萄糖蛋白胨水 方法：分别接种大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌 结果：加入甲基红指示剂2d，混匀，红色为阳性，黄色为阴性。大肠+，肺杆-,10,苯丙氨酸脱氨酶试验： 原理：某些细菌（如变形杆菌属），可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱氨生成苯丙酮酸，加入三氯化铁试剂与苯丙酮酸螯合后形成 绿色化合物。 培养基：苯丙氨酸琼脂培养基 方法：分别接种大肠埃希菌和变形杆菌，37 孵育16-18h 结果：滴加100 g/L三氯化铁试剂，出现绿色为+，不变为-。变形为+，大肠为-。,11,柠檬酸盐利用试验： 原理：当细菌可以利用铵盐作为唯一的氮源，同时利用柠檬酸钠作为唯一碳源时，可在柠檬盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐为碳酸盐，使培养基变碱，指示剂溴麝香草酚蓝由绿色变为深蓝色，为柠檬酸盐利用试验阳性。若不能利用则不能生长，培养基不变色，为阴性。 培养基：西蒙柠檬酸盐培养基 方法：分别接种大肠埃希菌和变形杆菌，37 孵育16-18h 结果：大肠-（绿色），变形+（蓝色）,12,结果判断,KIA：观察上部和下部的颜色变化，变黄为产酸，变红为产碱，有气泡为产气，有黑色为产硫化氢。 动力（M）：半固体上沿穿刺线生长，周围清澈，为阴性，周围混浊者为阳性 。 吲哚（I）：-在蛋白胨水中滴加靛基质试剂2-3滴，立刻变红者为阳性，不变为阴性。 尿素酶试验（U）：变为深粉红者为阳性，不变或变黄者为阴性。 甲基红试验（Mr）：-在葡胨水中滴加甲基红试剂2-3滴，变红为阳性，变黄为阴性。 枸橼酸盐利用试验（C）：细菌在上生长，颜色变为蓝色为阳性，细菌不长或培养基颜色不变为阴性。 苯丙氨酸酶试验：-在斜面上滴加试剂滴，变成暗绿色为阳性，不变为阴性。,13,KIA 用酚红作指示剂（ 6.8黄8.4红）， 1细菌如能发酵乳糖和葡萄糖产酸产气，则斜面及底层均呈黄色，且有气泡。 2如只发酵葡萄糖不发酵乳糖，因 葡：乳为1：10，斜面所产生的少量的酸可因接触空气而氧化挥发，从而使斜面部分保持原来的红色，底层同于是在相对缺氧的状态下，所生成的酸不被氧化挥发而保持黄色。 3如细菌分解蛋白质产生硫化氢，则成硫化亚铁生成硫化铁黑色沉淀物，使培养基变黑。 4接种方法：先穿刺到底，再在斜面划线。,14,结果观察,细菌名称 KIA M I U Mr C 苯丙氨酸 大肠 A/A + + - + - - 福氏 K/A - - - +/- - - 宋内氏 K/A - - - + /- - - 伤寒 K/A + - - + +/- - PA K/A + - - + - - PB K/A + - - + + - 肺克 A/A - - - - + - 变形 K/A + + + + +/- +,15,志贺氏菌属血清凝集,四种多价血清（NS对照） 凝集 福氏多价血清凝集 宋内氏多价血清凝集 福氏志贺菌 宋内志贺菌,16,沙门菌属血清学凝集,A-F多价“”血清（对照） 凝集 单价血清 血清型 菌名 PA甲 PB乙 丙 伤,17,
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