单克隆抗体技术医学PPT

单克隆抗体技术,提纲,单克隆抗体的概念单克隆抗体的制备单克隆抗体的应用,莱克多巴胺单克隆抗体,1975年英国科学家Milstein和Kohler将产生抗体的淋巴细胞同肿瘤细胞融合，成功建立了单克隆抗体技术，而获得1984年诺贝尔医学和生理学奖。每个B淋巴细胞仅专一地产生、分泌一种针对某种抗原决定簇的特异性抗体，而肿瘤细胞可以无限增殖，因此杂交瘤细胞可在体外培养或移植到体内条件下分泌大量单克隆抗体。 单克隆抗体技术的最主要优点是可以用不纯的抗原分子大量制备纯一的单克隆抗体。,一、单克隆抗体的概念（monoclonal antibody, McAb）,概念：通过B细胞杂交瘤技术, 获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆产生的具有均一性抗体的技术。细胞克隆：由一个细胞增殖而成的细胞集团。,B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。,杂交瘤技术,通过融合经过免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞，以获得同时具有抗体分泌功能和保持细胞永生性特征的杂交瘤细胞克隆。是获取单克隆抗体的主要技术途径。,二、单克隆抗体的制备,（一）制备原理：用缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT-）或胸腺嘧啶核苷酸酶（TK-）的瘤细胞变异株与脾脏的B细胞融合。采用HAT选择性培养基对融合细胞进行培养和筛选。HAT选择性培养基：培养基中加次黄嘌呤HyPoxanthine H，氨基喋呤Aminoopterin A及胸腺嘧啶核苷Thymidine T。,单克隆抗体制备原理,HAT培养基的选择原理：（1）氨基蝶呤(A)是叶酸拮抗剂，可阻断细胞利用正常途径合成DNA，细胞在含有氨甲蝶呤的培养基中不能通过正常途径合成DNA。（2）瘤细胞是HGPRT酶阴性细胞，自身不能通过替代途径合成DNA而繁殖。（3）B细胞虽含有HGPRT，但不能在体外培养存活（只存活57d，且功能下降)。（4）融合细胞含有B细胞和瘤细胞，其中瘤细胞核利用B细胞的HGPRT酶进行旁路合成DNA而存活。,单克隆抗体的制备原理,经HAT选择后的各种细胞的结果,融合的B细胞和瘤细胞; 由于杂交细胞获得了：（1）HGPRT、 TK 酶基因并正常表达、利用培养基中的H、T 合成DNA（2）瘤细胞的“永生性”而得以存活和无限扩增。未融合的B细胞、融合的B细胞和B细胞以及B细胞的多聚体; 因不能正常合成DNA而死亡未融合的瘤细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、以及瘤细胞的多聚体等; 因不能正常合成DNA而死亡。,（二）基本制备流程,（三）单克隆抗体的制备步骤,1、免疫原的制备2、免疫动物3、骨髓瘤细胞的准备4、细胞融合5、杂交瘤细胞及阳性孔的筛选6、阳性孔的特异性检测及特异性阳性孔的克隆7、单克隆抗体的制取,1、免疫原的制备,颗粒性抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白等分子量大于5000Da生物物质。可溶性抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于 5000 Da 物质。注意：可溶性抗原需与BSA、OA等载体交联后成颗粒性抗原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体。,2、免疫动物,（1）动物选择：一般采用与骨髓瘤细胞供体来源同一品系的动物进行免疫（如：小鼠）。由于免疫动物品系与所采用的骨髓瘤细胞差异较远，产生的杂交瘤细胞稳定性越差。（2）抗原与载体：抗原分为可溶性和颗粒性抗原，载体分膜体和珠体。（3）免疫途径：较为常用 的途径有腹腔，皮下淋巴器官或静脉等，较为常用的途径是腹腔注射。,2、免疫动物,可溶性抗原（蛋白质）： 以1mg/ml5mgml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml0.6ml，间隔周再同样注射一次，10天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原0.2ml0.4ml，天后，杀死小鼠取脾做融合用。颗粒性抗原 如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间。例如用羊红血球免疫小白鼠，以浓度每只皮下注射.ml，每周次，共免疫次，取脾前天，再免疫一次即可。,为什么要多次免疫小鼠？,正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的B淋巴细胞，一只纯种小白鼠估计能产生1.01075.0107种不同的抗体。因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合，只能有千万分之一的机会获得某一种特定抗体。所以为了提高得到某种杂交瘤的机会，必须加强免疫，使产生特异性抗体的B淋巴细胞大量增加。,3. 骨髓瘤细胞的准备,细胞株处于良好的生长状态，本身不能分泌任何抗体或免疫球蛋白； 瘤细胞的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者组织相容性抗原一致； 细胞株保持HGPRT缺陷状态或TK缺陷状态。,4. 细胞融合,（1）细胞融合剂和融合手段 病毒融合：高浓度仙台病毒等 化学融合剂：PEG等 电融合技术：国产新芝牌电融合仪（2）融合技术 一种是加入融合剂后直接离心使两种细胞紧密接触（R3000r/min），另一种是加入融合剂后轻轻搅动融合。,（3）提高融合频率的可能途径 融合过程中由于细胞特性、操作过程、PEG毒性等多种因素都可能影响融合而减少融合频率。 方法：对亲本细胞预处理，改进融合技术，加入饲养层细胞促进杂交瘤生长。,致敏淋巴细胞,骨髓瘤细胞,离心 1000rpm 10min,50%PEG 1ml,培养液 10ml,离心 1000rpm 7min,37。C摇动、由慢渐快1min、静止1.5min,加入HAT培养液悬浮细胞，置于培养孔内,5. 杂交瘤细胞及阳性孔的筛选,细胞培养器皿中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HAT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10%-50%时，常规间接ELISA方法筛选阳性孔，共获50多个对上述抗原有反应的阳性孔。,融合细胞的筛选方法,A）ELISA（酶联免疫吸附测定法）用于可溶性抗原(蛋白质)、细胞和病毒等单克隆抗体（McAb）的检测。B）放射免疫法 （RIA）用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。C）FACS(荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞表面抗原的McAb检测。D）间接免疫萤光法 （IFA）用于细胞和病毒McAb的检测。,6. 阳性孔的检测,6.融合细胞的克隆,经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。 克隆化的方法很多，包括有限稀释法、显微操作法、软琼脂平板法及荧光激活分离法等。,有限稀释法,计数,103/ml,102/ml,10/ml,0.5-2/孔,7. 单克隆抗体的制取,制取方式：体外培养罐法体内腹腔接种纯化：盐析、层析、制备型HPLC鉴定：特征鉴定Ig类型、亲和力、效价、特异性决定簇鉴定是否针对同一决定簇,（1）体外制备,体外使用旋转培养瓶大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为1060g ml。如果大量生产，费用较高。 随着大规模的生产，需大量血清而使成本增加，同时血清会影响单抗的纯度，大量血清的存在干扰抗体活性。1978年iscove用补充大豆类脂，牛血清蛋白，转铁蛋白等添加成分的无血清培养基培养杂交瘤细胞成功。,（2）体内制备,体内腹腔注射杂交瘤细胞，接种细胞710天后可产生腹水，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获110ml腹水。可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml， 这是目前最常用的方法。在动物体内制备单抗，可在短时间获得足够量的单抗够实验室应用，但要消耗大量活的小鼠而不适合规模化生产。同时腹水中可能混有小鼠本身的抗体会给单抗的纯化带来困难。,杂交瘤细胞的冻存,当获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须将一部分杂交瘤细胞保存，否则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。另外在长期的培养过程中，难免不发生污染以至于毁灭。所以必须冷藏保存一部分。,杂交瘤细胞通常用含有8-10%的二甲亚砜和20小牛血清的培养基冻存于液氮中，在液氮中细胞可以保存多年，在-80中可以作3-6个月短期保存。冻存细胞需要缓慢降温，复苏细胞时需快速升温，这样可以确保细胞有较高的存活率。,单克隆抗体的特性, 单一特异性，与一个抗原决定簇反应； 可重复性，能够提供完全一样的抗体制剂； 一经制出，可无限量地供应； 生产单克隆抗体，不一定需要纯的抗原； 能查出混合物中存在的用常规方法查不出的少量成分。,局限性,（1）单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。（2）单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。（3）制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高,三、单克隆抗体的应用,单克隆抗体在医学上的应用 1）单克隆抗体的靶向制剂 2）单克隆抗体在肿瘤诊断与治疗中的应用 3）单抗药物制备方法： 与药物直接连接McAb 小分子 药物 大分子 药物,（1）药物与抗体直接偶联通过化学反应使药物分子的氨基与抗体分子的羧基之间直接形成稳定的酰胺键。利用氧化剂把药物分子上的糖基氧化成羰基利用羰基与抗体分子的氨基反应形成西弗氏碱，最后还原。这样的靶向制剂保留一定的药物活性，并具有一定的选择性。如：1,4-溴柔红霉素与肿瘤细胞单抗形成的偶合物，对肿瘤有明显的选择毒性。,小分子交联剂：同型双功能：戊二醛、顺乌头酸酐、马来酸酐、戊二酐。异型双功能：N-琥珀酰胺基-3-丙酸和寡肽等。大分子聚合物：葡聚糖、多聚赖氨酸、多聚谷氨酸、聚合多肽和血清蛋白等,单抗药物,特异性溶解血栓药物抗肿瘤药物其它药物利妥昔单抗是全球第一个上市的单克隆抗体药物。,单抗药物面临的问题,单抗药物还存在一些尚未解决的问题，最突出的问题是如何降低单抗的免疫原性，单抗的异源性所引起的抗体反应，不但降低了单抗的效价，而且会给患者带来严重的后果。因此，对异源性单抗进行改造以及人源性单抗的研制成为单抗研究的重点。,