Illumina平台测序原理及常见测序文库构建.ppt

Illumina 平台测序原理及常见几 种测序文库构建流程简介,目录,第一部分：测序测序原理与流程 简介,文库构建( 6 hrs),cBot HiSeq2500 MiSeq,HiSeq2000 HiSeq2500 GA IIx MiSeq,HCS/RTA ICS MSR CASAVA BaseSpace,1-8 samples,1-8 samples,DNA,Illumina 测序流程,文库构建( 6 hrs),cBot HiSeq2500 1-8 samples MiSeq HiSeq2000 HiSeq2500 1-8 samples GA IIx MiSeq HCS/RTA ICS MSR CASAVA BaseSpace,DNA,文库构建流程,片段化 DNA 末端补平 3加A 接头连接 PCR,高质量DNA文库结构,文库构建的目的是在目的DNA片段两端都连接上想要 的接头,此单链部分与 FlowCell表面上P7接 头相同,此单链部分与 FlowCell表面上P5接 头相同,Index Sequencing Primer,文库构建( 6 hrs),cBot HiSeq2500 MiSeq,1-8 samples,HiSeq2000 HiSeq2500 1-8 samples GA IIx MiSeq HCS/RTA ICS MSR CASAVA BaseSpace,测序芯片 (Flow Cell)简介,flow cell是有2个或8个泳道(Lane)的 玻璃片，与一元硬币的厚度相当,每个泳道(Lane)内的上下两个表面 随机的布满了能够与文库两端接头 分别互补配对的寡核苷酸(oligos,P7 和P5接头),在flow cell上进行cluster簇生成,仪器简介,单条DNA 模板,约1000条 DNA模板的 拷贝,cBot,HiSeq Sequen,ncceerr,35个循环的桥式PCR,cBot 工作流程,DNA文库变性：使用NaOH将双链DNA文库变性为单链 模板链杂交： 将单链DNA模板杂交到Flow Cell 上 第一链合成： 以Flow Cell 表面上的oligos为引物， 合成第一链,桥式PCR：,冲走单链DNA模板，以合成的第一链 为模板进行35循环的桥式PCR,线性化：,将与P5接头连接的DNA链从Flow Cell 上去除,阻断3OH：,防止在后续测序过程中继续延伸DNA链,杂交测序引物,DNA模板杂交和一链合成,接头序列,5-3 延伸,含有P7和P5两种接头 的FlowCell表面,单链DNA分子与FlowCell 表面的对应接头杂交 以杂交的单链DNA为模板， FlowCell上的接头为引物， 合成第一链,新合成的链,原始模板链,双链DNA变性,丢弃原始模板链,模板链被冲洗走,新合成的链留在FlowCell 上,桥式PCR扩增,单链DNA与FlowCell表面对应接头杂 交，形成“桥”,以接头为引物进行扩增,桥式PCR扩增,变性,变性双链的“桥”,得到与FlowCell相连的两条互补 的单链DNA分子,第二轮桥式PCR扩增,完成桥式PCR扩增,完成28循环的桥式PCR,线性化,双链“桥”变性为单链,红色箭头为P5接头上的 切割位点,线性化,切割并冲走与P5接头相连的那 条DNA链,阻断,阻断3 OH,杂交Read 1 引物,Read1 测序引 物,将测序引物杂交到文库的接头上,Illumina 测序流程,HiSeq2000 HiSeq2500 GA IIx MiSeq,HCS/RTA ICS MSR CASAVA BaseSpace,文库构建( 6 hrs) cBot HiSeq2500 1-8 samples MiSeq,1-8 samples,进行Read1 测序 杂交Index 测序引物，进行Index 测序 Paired End Turnround，合成Read1互补链 杂交Read 2 测序引物，进行Read 2 测序,HiSeq SBS 测序流程,HiSeq SBS 测序流程,1,2,3,Paired End Turnaround,Sequencing By Synthesis，SBS测序原理,4种 Fl-NTPs + 聚合酶,拍照，收集信号,去阻断，切除荧光基团,X 36 - 151,可逆终止化学反应,一次加入4种修饰的dNTP(可逆终止子) 准确度高 可以得到同聚物序列,合成 照相，收集信号 去阻断，切除荧 光基团,下一个碱基合成,100 Microns,Clusters,已完成测序合成的片段,Blocked 3-ends,变性掉已完成测序合成的 片段,恢复被阻断的3 OH,Paired End Turnround,形成的 桥,5-3延伸,桥式PCR,5-3延伸,Paired End Turnround,形成的双 链的桥,Paired End Turnround,模板链,Paired End Turnround,等温变性，完成15轮桥式 PCR后，进行线性化，将模 板链切除，保留新合成的子 链,新合成的 链,3 -OH阻 断,Read2测序引 物,Paired End Turnround,线性化，3 -OH阻断,杂交Read2测序引物,Sequencing By Synthesis 2nd Read,X 36 - 151,4种 Fl-NTPs + 聚 合酶,拍照，收集信号,去阻断，切除荧光基团,Illumina 测序流程,HCS/RTA ICS MSR CASAVA BaseSpace,文库构建( 6 hrs) cBot HiSeq2500 1-8 samples MiSeq HiSeq2000 HiSeq2500 1-8 samples GA IIx MiSeq,第二部分：常见文库构建流程简 介,文库分类,DNA类文库 DNA小片段文库 DNA大片段文库 Exon文库 PCR-Free文库 简化基因组文库、单细胞样本 文库等,RNA类文库 转录组文库 表达谱（RNA-Seq） Small RNA,DNA小片段文库,DNA小片段文库 片段大小在1Kb以下的普通DNA文库 （200bp,350bp,500bp） DNA小片段文库可用来进行人重测序，动植物、 微生物的de novo和重测序，16s rRNA测序， 宏基因组测序等项目类型的文库构建。,DNA小片段建库流程,DNA小片段建库流程,DNA小片段建库流程,DNA小片段建库流程,DNA大片段文库,DNA大片段文库，又名末端配对（mate-paired） 文库 片段长度大于1K bp。 主要用于动植物，微生物的de novo 测序,DNA大片段文库建库流程,DNA大片段文库建库流程,为什么要建大片段文库,Exon文库,人类外显子组总共约30Mb，占全 部人类基因组约1%。 外显子具有高度的保守型，且大部 分疾病的致病位点位于外显子区。 外显子测序是指利用序列捕获技术 将外显子区域DNA捕捉并富集后 进行高通量测序的基因组分析方法。 Exon文库主要用于人全外显子测 序和目标区域测序,Exon文库流程,外显子捕获方式,液相杂交 液相杂交是通过在溶液中， 利用链碱基配对的原理， 将DNA片段与探针杂交， 然后洗脱，富集目的片段。,Exon测序特点,优点： 1、 与全基因组测序相比，外 显子测序具有测序覆盖度更深、 数据准确性更高、花费成本更 低等优势，对研究已知基因的 SNP、Indel等具有较大的优势。,不足： 1、与全基因组测序相比，不能 检测到基因组内较大的结构性 变异。 2、与转录组测序相比，不能检 测到新的基因。,PCR-Free文库,PCR-Free文库，顾名思义，就是在文库构建过 程中不需要进行PCR的文库。 主要是针对一些特殊样本，比如GC含量高， PCR扩增困难的样本；PCR产物。 不足： 所需的样本起始量较多。,PCR-Free文库与普通文库比较,简化基因组(RAD-seq )文库,RAD-seq 即基于酶切的简化基因组测序技术，是指利用 限制性内切酶对基因组进行酶切，结合一定大小的插入片 段文库，对其进行高通量测序，快速鉴定高准确性的变异 标记（SNPs）信息的技术 与传统技术相比，该类技术操作简单、不受参考基因组限 制、可简化复杂基因组；另外，基于SNPs 的分子标记技 术性价比高，稳定性好，在基因组中分布更加广泛，特别 是适合大样本量的分析。,简化基因组文库建库流程,转录组文库,真核生物,原核生物,总RNA,利用Oligo (dT)富 集mRNA,去除 rRNA,随机引物六聚体反转 录合成cDNA,末端修复，加A，加 接头后PCR扩增,Illumina 测序,将mRNA 随机打断成 200 nt,转录组测序的研究对 象为特定细胞在某一 功能状态下所能转录 出来的所有mRNA。 应用： 转录本的种类和基因 定量 基因的转录结构 可变剪切 发现新的转录本,链特异性转录组建库,使用ssRNA-seq可以确定转录本是来自正链还是负链。以 便更加准确的获得基因的结构以及基因表达信息，并且发 现新的基因。 很多基因组区域具有正负链的转录本，反义转录是真核基 因的一个特征，是一种重要的调控方式。,常规转录组建库方法基 础上，在合成第二条 cDNA链时，替换dTTP 为dUTP，加上接头后降 解含dU的DNA单链。,链特异性转录组建库,均一化（DSN）建库,方法：构建常规转录组文库，库检合格后取80-100ng文库进行DSN处 理，然后PCR再次出库。 目的：减低高丰度表达基因，有效富集低丰度表达基因。 DSN酶：双链特异性核酸酶(Duplex-Specific Nuclease, DSN)，能够选 择性降解双链DNA和DNA-RNA杂交体中的DNA,由于高丰度的基因形 成双链的速度较快，所以降解也比较多。,RNA-Seq,是用来研究某一生 物对象在特定生物 过程中基因表达差 异的技术，具有定 量准、可重复性高 、检测范围宽、成 本低等特点。,真核生物,原核生物,总RNA,利用Oligo (dT)富集 mRNA,去除 rRNA,随机引物六聚体反转录合 成cDNA,末端修复，加A，加接头后 PCR扩增,Illumina 测序,将mRNA 随机打断成 200 nt,RNA-Seq 与常规转录组区别,Small RNA 文库,18-30nt范围内的RNA 结构上5端主要以尿嘧啶开始 与mRNA的降解、翻译抑制（基因沉默）以及形 成异染色质有关 调控细胞生长、发育、基因转录和翻译等生物过程 包括siRNA , microRNA和piRNA,Small RNA 文库建库流程,谢谢！,欢迎一起讨论！,