实时荧光定量PCR的原理、操作及其应用.ppt

实时荧光定量PCR的原理、操作及其应用,- 分子生物学实验技术 系列讲座,河南农业大学生命科学研究中心 张志坤,2009.12.7,大纲,一.原理概述 二.操作及结果分析 (一).样品制备 (二).引物及探针的设计与合成 (三).标准品的制备-质粒或纯化后的PCR产物 (四).通道的选择及增益的选择 (五).标准曲线的建立 (六).加样时应注意的细节 (七).阈值的选定 (八).熔解曲线分析 (九).操作流程 三.应用 (一).绝对定量分析 (二).相对定量分析及实验方案 (三).SNP检测分析,一、原理概述,1.Real-Time PCR 概论 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。 实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整 个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方 法。 定量PCR仪是在普通PCR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检测装置，PCR扩增和检测同时进行，最终结果不需进行电泳检测，所以有效地避免了样品间的交叉污染。 常 规 PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板 准确定量，无法对扩增反应实时检测。 实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产 物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量 分析。,一、原理概述,2.定量PCR常用的三个常用概念 扩增曲线、荧光阈值、Ct值 (1).扩增曲线：反映PCR循环次数和荧光强度的曲线，定量PCR仪每次轮PCR扩增都会自动 录荧光强度的变化,每个循环进行一次荧光信号的收集,一、原理概述,2.定量PCR常用的三个常用概念 扩增曲线、荧光阈值、Ct值 (2).荧光阈值：样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，手动 设置的原则要大于样本的荧 光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶 段，并且保证回归系数大于0.99。 (3).CT值： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环 次数。,一、原理概述,3.荧光定量PCR所用的荧光报告基团 (1).非特异性荧光标记： SYBR Green (2).特异性荧光标记： TaqMan探针 Molecular Beacon分子信标,一、原理概述,4.非特异性荧光染料-SYBR Green的特性 (1).SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 (2).SYBR Green 只有和双链DNA结合受激后才发 荧光 (3).变性时，DNA双链分开，无荧光 (4).复性和延伸时，形成双链DNA,SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。,SYBR Green,SYBR Green,一、原理概述,4.非特异性荧光染料-SYBR Green的工作原理图解,伴随着每轮PCR的进行，特异的基因片段不断积累，SYBR Green不断的与新增加的基因片段结合而发出荧光，荧光信号不断积累，荧光定量PCR仪实时记录了荧光信号的变化。,一、原理概述,5.非特异性荧光染料SYBR Green的优缺点 优点： (1).对DNA模板没有选择性-适用于任何DNA (2).使用方便-不必设计复杂探针 (3).非常灵敏 (4).可做熔解曲线分析 (5).便宜 缺点： (1).对引物特异性要求较高 (2).与非特异性双链DNA结合，产生假阳性,干扰实验的准确性,尤其 是分析表达量不高的基因时,这类情况尤其突出; 需要不断的优化反 应体系,降低非特异性扩增.,一、原理概述,6. TaqMan-水解型杂交探针,TaqMan探针的特性： (1).5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 (2).3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) (3).探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分 开，发荧光 (4).Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针,一、原理概述,6. TaqMan-水解型杂交探针工作原理,每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光,一、原理概述,7.探针法的优缺点 (1).极高的特异性和准确性 由于探针法除了引物序列的特异性之外，还有探针 序列的特异性，从两个方面保证了所 扩增基因的特异 性。 (2).良好的重复性 (3).目前合成价格较贵. (4).不能做熔解曲线分析.,一、原理概述,8.荧光定量PCR的数学原理 理想的PCR反应： X=X0*2n (扩增效率=1) 实际的的PCR反应： X=X0* (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率,一、原理概述,8.荧光定量PCR的数学原理 在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M 方程式(1)两边同时取对数得: log M=log X0 (1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3) log(1+Ex) *Ct= -log X0 + log M (4) Ct= -log X0 + log M (5) log(1+Ex) Log（x0的初始模板量）与到达阈值时的循环数（Ct值）呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量,一、原理概述,8.荧光定量PCR的数学原理,模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量,一、原理概述,8.荧光定量PCR的数学原理,确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量,一、原理概述,9.认识一下荧光定量PCR仪 仪器本身的功能： 1、控制参数（温度） 2、控制循环数（时间） 3、记录整个循环过程中的荧光值的变化，在所有的时 间和温度条件下，仪器都会忠实的记录下荧光值的 变化。 荧光定量PCR仪就是通过对所记录的参数来计算样品的初始模板量的。,循环数和荧光值曲线,温度和荧光值曲线,一、原理概述,ABI 7300型96孔荧光定量PCR仪， 由于样品间存在光程差，需ROX校正。,RoterGene3000型36孔 荧光定量PCR仪，旋转 加热式，不需ROX校正,二、操作及结果分析,1、样品的制备 DNA样品，主要是DNA提取，提取的DNA可TE缓冲液溶解后-20度保存；对于RNA样 品，抽提RNA后要迅速反转录，将RNA反转录为cDNA，TE缓冲液溶解后可-20度保 存。 DNA或cDNA样品也不要长期存放，因为在存放过程中会有少量的DNA降解，从而 影响样品中目的基因的含量。 对于大量的样品最佳的检测方案是： 根据实际情况安排好每天要提取的样品数量，提取后若是RAN立即进行反转录反 应，并且将当天反转录的样品进行定量PCR检测；千万不可先将所有的样品都提取RNA，提取完RNA后再统一反转录，然后在对cDNA样品进行定量检测，千万不要这样做，因为RNA是极不稳定的，哪怕是存放于-80度冰箱，一方面RNA极其容易降解从而影响检测的准确性，另一方面万一实验室的超低温冰箱放生故障造成停机或停电，那所有提取的RNA将会很大程度的降解，对样品造成不可挽回的损失！ 最好的安排是：当天提取或反转录的样品，当天就进行定量PCR的检测，最大程度的减少RNA的降解，这样测定的结果才更准确。,二、操作及结果分析,2、定量PCR引物及探针的合成 定量PCR所扩增的片段长度一般都不超过300bp，这样才能确保结果更准确；染料法对引物的特异性要求较高，探针法对引物的特异性要求不高，探针法所扩增的片段长度更短，一般都在200bp以下。引物和探针都要进行Blast分析，以避免非特异性扩增。,二、操作及结果分析,3、标准品的制备-质粒或纯化后的PCR产物 这一步骤一般在预实验时完成，严格意义上的操作要求将PCR产物切胶后进行胶回收，并进行质粒的连接、转化到感受态大肠杆菌中，质粒在大肠杆菌中增值后提取质粒，并用分光光度计测定含有PCR产物的质粒的OD值，借此来确定质粒的摩尔量，将已知摩尔量的质粒做5倍或10倍的连续梯度稀释，做成质粒标准品，这是准确测定样品中目的基因模板量的定量基础。 现在也有的不做质粒，直接测定纯化后的PCR产物的摩尔量，然后梯度稀释PCR产物，以此来作为标准品。 一般做四个标准品左右 5-25-125-625-3125 10-100-1000-10000-100000,二、操作及结果分析,4、通道的选择及增益的选择 对于任何一款荧光定量PCR仪来说，都有一组或几组激发光和滤光片以及相应的检测器和滤光片，这些就构成了定量PCR仪的通道。不同的发光基团都有相应的激发光和相应的检测器。定量PCR仪从最初的单通道发展到现在的多通道，常用的通道有FAM/HEX/JOE等。可根据自己所用的发光基团来选择相应的通道。 增益（gain），是荧光信号的放大倍数，发光基团的荧光是很微弱的，必须经过适量的信号放大才能被检测，否则，整个扩增曲线的荧光强度非常小，以致无法准确检测。所以在实验前，要选择合适的增益倍数。,二、操作及结果分析,5、标准曲线的建立,梯度稀释后，标准品的扩增曲线间距相等，标准曲线上的间距也相等， 说明标准曲线建立的很成功，假如间距参差不齐，说明梯度稀释时操作 误差太大，建议重新做标准品的梯度稀释，重新做标准曲线，直到扩增 曲线之间的间距相等为止。因为这一步直接影响着样品中目的基因 原始模板量的准确性。,二、操作及结果分析,6、加样时的操作 所有的加样操作要围绕着尽量使反应体系均一化为目的，除了样品外，其他试剂都要进行预混，预混后分装到各个PCR管中，最后加样品，移液器要尽量准确，因为这一步的操作可以说是差之毫厘，谬以千里。,二、操作及结果分析,7、阈值的设定 定量PCR反应结束时开始对结果进行分析，此时需要划定阈值，也就是在扩增曲线的指数期划一条直线，这条线就叫阈值线，在阈值线上，所有的样品的荧光值都一致相同，不同的只是所对应的CT值和初始模板量！ 阈值的设定要尽量让回归系数最大！,图中的虚线即为阈值线,二、操作及结果分析,8.熔解曲线分析 熔解曲线（melt分析）是指定量PCR反应结束后让样品继续升温直到PCR产物的双链全部打开，这时由于双链打开，荧光染料不发荧光，这样荧光值会有一个陡然的突降，借以检测PCR产物的特异性，相当于进行电泳检测。因为不同的PCR产物片段其TM值不同，单一的双链DNA其荧光陡降的温度一致，加入含有非特异性扩增产物，那么其荧光陡降的温度不止一个（两个或更多或杂乱无章）。如图：,特异性强的溶解曲线,二、操作及结果分析,8.熔解曲线分析,二、操作及结果分析,9、操作流程 确立实验方案 样品制备 设计引物及探针 预实验 标准品及标准曲线的建立 定量PCR检测 分析数据,三、荧光定量PCR技术的应用,1、绝对定量分析 这是荧光定量PCR技术的直接应用，可用于检测病毒及细菌的浓度！,三、荧光定量PCR技术的应用,2、相对定量分析及实验方案 基因表达(gene expression)是指细胞在生命过程中,把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译,转变成具有生物活性的蛋白质分子. 遗传物质DNA首先要把所携带的遗传信息转录成为信使RNA（mRNA）,携带遗传信息的mRNA从细胞核进入到细胞质中与核糖体结合，在核糖体中mRNA携带的遗传信息被翻译成为多肽，多肽经过进一步加工后变成蛋白质，至此遗传物质DNA完成了表达过程。期间的转录过程是基因表达中非常重要的调节步骤，所转录的mRNA的多少直接影响着相关最终蛋白质的多少，所以通过对细胞内某条基因mRNA含量多少的分析，就能大致判断出该条基因的表达是否活跃。,三、荧光定量PCR技术的应用,2、相对定量分析及实验方案 研究基因表达的情况，我们只需搞清楚该基因在不同生理阶段的变化趋势如何就行了，而无需知道该基因的绝对量有多少。基因表达调控研究中，由于RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，这就造成了比较上的混乱，因此在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。所谓的看家基因即内参基因，是指在各生理阶段表达量恒定的基因，也称奢侈基因，该基因表达一般不随外界的变化而变化，所以常被用作参照，常用的内参基因有GAPDH基因、-Actin基因，18srRNA基因等。因此，在做基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。 假定在1生理时期，X基因的表达量为X1；其内参基因表达量为Y1；X1/Y1就将1生理时期的取样、RNA提取、纯化、反转录等过程的所有偏差均一化了；同样在2生理时期，X2/Y2就将2生理时期的取样、RNA提取、纯化、反转录等过程的所有偏差均一化了；最后（X1/Y1）/（X2/Y2），所得的值就能就能较为真实的反应在1、2生理时期，X基因的变化情况。 常用的相对定量方法主要有两种，双标准曲线法和Delta-delta Ct法。,三、荧光定量PCR技术的应用,2、相对定量分析及实验方案-双标准曲线法 所谓的双标准曲线法就是对内参基因和所研究的目的基因都做绝对定量，然后将各生理阶段的目的基因的量和内参基因的量相除，得出一个比值；最后再将不同生理阶段所得的比值相除，最终得出目的基因在不同生理阶段的表达变化。 双标准曲线法思路直观、条理清晰，最大限度的避免了实验的误差，是一种很好的分析方法。,三、荧光定量PCR技术的应用,2Delta-delta Ct法 此法是经定量的数学原理推导而来 该方法直接利用看家基因来校正样品初始量，但同时默认两个基因扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，因此实验条件需要严格优化，并且总会存一定的偏差。在预实验中，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。软件会自动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于0.1，表明两个基因的扩增效率已非常接近，那么后续实验中就可以用此法进行相对定量分析。反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。,三、荧光定量PCR技术的应用,3、SNP检测分析 基因组DNA是生物体各种生理、病理性状的物质基础。人类众多个体的基因组序列的一致性高达99%以上，但个体之间各种性状的差异仍然很大，包括对疾病的易感性、对同一疾病治疗药物的反应性等。在同一生物种群中明显存在两种以上不同的遗传性状，而且出现频率较高，称为遗传的多态性(polymorphism)，而遗传物质DNA的多态性如RFLP、STR、ABO血型、HLA和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)是个体间差异的遗传学基础。 SNPs是指在基因组水平上由于单个核苷酸位置上存在转换(C与T互换，在其互补链上则为G与A互换)或颠换(C与A，G与T，C与G，A与T互换)等变异所引起的DNA序列多态性。SNP是人类可遗传的变异中最常见的一种,占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每5001000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。,三、荧光定量PCR技术的应用,3、SNP检测分析 通常所说的SNP都是二等位多态性的，转换的发生率总是明显高于其它几种变异，具有转换型变异的SNP约占2/3，其它几种变异的发生几率相似。转换的几率之所以高，可能是因为CpG二核苷酸上的胞嘧啶残基是人类基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。 在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的SNP(cSNP)比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1/5。但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此cSNP的研究更受关注。 从对生物的遗传性状的影响上来看，cSNP又可分为2种：一种是同义cSNP(synonymous cSNP),即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；另一种是非同义cSNP(non-synonymous cSNP),指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能，这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。cSNP中约有一半为非同义cSNP。,三、荧光定量PCR技术的应用,3、SNP检测分析,SNP检测,（1）.对未知SNP 进行分析,即找寻未知的SNP 或确定某一未知SNP 与某遗传病的关系。最有效的方法是对那些含有SNP 的DNA 链进行测序，确认突变的位置和碱基类别。 （2）.对对已知SNP 进行分析,也就是基因分型，即对不同群体SNP遗传多样性检测或在临床上对已知致病基因的遗传病进行基因诊断。比较成熟的技术有Taqman探针法，尤其适合样品量特别大的情况。,三、荧光定量PCR技术的应用,3、SNP检测分析 根据已知的SNP位点变化设计出两种不同的探针，一种和野生型完全匹配，一种和突变型完全匹配；每一个样品都平行的做两次荧光定量PCR检测，一次添加野生型探针，一次添加突变型探针；针对特定的SNP位点，进行荧光定量PCR反应。由于SNP位点碱基的不同，所以扩增结果也有差异。探针序列和模板序列完全匹配时，扩增曲线正常；探针序列和模板不完全匹配时，扩增曲线不起跳，或者荧光量很弱Ct值很大；当样品为杂合子时，由于样品中含有和两种探针序列匹配的模板，所以此时扩增曲线几乎完全重合。这种差异就反映在扩增曲线上。如图：,野生型,杂合型,纯合型,荧光定量PCR图片,荧光定量PCR图片,荧光定量PCR图片,荧光定量PCR图片,