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生物技术实践,选修1,专题1 微生物的利用,一、微生物的实验室培养 1培养基 (1)概念：人们按照微生物对_的不同需求，配制出供其_的营养基质。,营养物质,生长繁殖,(2)成分：尽管培养基的配方各不相同，但其基本成分都包括_ 、_ 、_和_。还需满足不同微生物对_、特殊营养物质以及_的要求。 (3)培养基配制的程序：计算_溶化灭菌倒平板。,水,碳源,氮源,无机盐,pH,氧气,称量,2无菌技术,温和,内部一部分,煮沸消毒法,巴氏消毒法,强烈,内外所有,灼烧灭菌法,高压蒸汽灭菌法,3微生物培养的基本技术 (1)纯化大肠杆菌的原理：在培养基上将稀释的细菌分散成单个菌落，会形成一个肉眼可见的、具有_的子细胞群体，叫做_。菌落是鉴定菌种的重要依据。 (2)微生物纯化的培养方法(两种接种方法)：,一定形态结构,菌落,平板划线法,简单,单菌落易分离,复杂,4,甘油管藏,20,脲酶,制备培养基,细菌的计数,稀释涂布平板,复合,C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶,纤维素酶,葡萄糖,刚果红染色法,透明圈,1培养微生物的培养基 (1)培养基的配制原则 目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。 营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。 pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同，如细菌为6.57.5，放线菌为7.58.5，真菌为5.06.0，培养不同微生物所需pH不同。,微生物的培养与应用,(2)培养基的种类与用途,微生物最常用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常利用的氮源是铵盐、硝酸盐。 对异养微生物来说，含C、H、O、N的有机化合物既是碳源，又是氮源、能源。有些培养基不需要添加特殊营养物质，生物自己能合成，如大肠杆菌能合成某些维生素作为特殊营养物质。,2微生物培养的无菌技术 进行无菌操作主要是为了防止外来杂菌的入侵，重点是消毒和灭菌。 (1)消毒和灭菌的区别,(2)无菌技术的操作要求 实验前应对操作空间、操作人员进行消毒；对所用器具和培养基进行灭菌。 实验进行时需在酒精灯火焰周围的无菌区操作，另外要避免已灭菌处理的材料再次污染。,用酒精消毒时，70%的酒精杀菌效果最好，原因是：浓度过高，使菌体表面蛋白质凝固成一层保护膜，乙醇分子不能渗入其中；浓度过低，杀菌力减弱。,(3)三种常用灭菌方法的比较,3大肠杆菌的纯化以及菌种的保藏 (1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 步骤：计算称量溶化灭菌倒平板。 注意事项：a.倒平板的适宜温度是50 左右，温度过高会烫手，过低培养基又会凝固；b.平板需倒置，这样既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,(2)纯化大肠杆菌 原理：在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个菌落，这个菌落就是一个纯化的细菌菌落。 方法：平板划线法、稀释涂布平板法。 平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面；稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。,(3)菌种的保藏 临时保藏：固体斜面培养基上4 保存，菌种易被污染或产生变异。 长期保存：20 甘油管在冷冻箱中保藏。,解析 本题考查平板划线操作方法。在每次划线前后都要对接种环进行灭菌，接种环的灭菌方法应是在火焰上灼烧，接种时划线操作是在火焰旁进行。在5个区域中，只要有单个活细菌，通过培养即可获得所需菌落。 答案 D,(2013成都模拟)关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述错误的是( ) A操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌 B将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯 C等培养基冷却至50左右进行倒平板 D待平板冷却凝固510 min后将平板倒过来放置 【答案】A,【解析】操作顺序为先灭菌再倒平板；牛肉膏会黏附在称量纸上，应该将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯；培养基冷却至50左右既没有凝固，同时又不烫手，可以进行倒平板；为了防止冷却过程中培养皿盖上凝集的水珠对平板的污染，培养基冷却凝固后就要将平板倒过来放置。,1测定微生物数量的方法 (1)显微镜直接计数法 原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。 缺点：不能区分死菌与活菌。,特定微生物的数量的测定,(2)间接计数法(活菌计数法) 方法：一般用稀释涂布平板法，当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，就是来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。,注意事项 a设置重复组，增强实验的说服力与准确性。 b为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板进行计数。 计算公式：每克样品中的菌株数(C/V)M，其中C表示某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V表示涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M表示稀释倍数。,(2)检测天然水源中的细菌总数和大肠杆菌菌落数： 细菌总数通常是指1 g或1 mL检测样品中所含细菌菌落的总数。大肠杆菌菌落数通常是指每100 g或100 mL检测样品中所含细菌的实际数值。 (3)检测某种食品中的细菌总数和大肠杆菌菌落数： 一般说来，大肠杆菌菌落总数越多，说明食品的卫生质量越差。 (4)土壤中分解尿素细菌的计数 某些细菌中含有尿素分解酶，能将培养基中的尿素分解成氨，该物质的水溶液会使酚酞指示剂呈现红色。,3制备系列稀释液的方法 将1 g土样放入99 mL无菌水中，制成102倍的稀释液，用1 mL无菌移液管吸取上述浓度的溶液0.5 mL，移入装有4.5 mL无菌水的试管中，即配制成103倍的稀释液，用同样的方法可以配制成104、105、106倍的稀释液。将待测样品进行稀释的目的是使微生物细胞分散开，使实验结果更接近真实值。,(2013江苏模拟)用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是( ) A涂布了一个平板，统计的菌落数是230 B涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238 C涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163 D涂布了三个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值233,解析 在设计实验时，一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，所以A、B项不正确。C项虽涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另外两个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，此时，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值 答案 D,(2013广东深圳一模)某学者欲研究被石油污染过的土壤中细菌数量，并从中筛选出能分解石油的细菌。下列操作错误的是( ) A利用平板划线法对细菌进行计数 B用以石油为唯一碳源的培养基筛选 C采用稀释涂布平板法分离菌种 D称取和稀释土壤时应在火焰旁 【答案】A 【解析】平板划法能对细菌进行分离纯化，但不能对细菌进行计数，稀释涂布平板法可以分离菌种还可进行计数，A项错误。,1分离微生物的方法 从混合样品中获得某种微生物的方法通常有两种： (1)利用该分离对象对某一营养物质有“嗜好”的原理，专门在培养基中加入该营养物质，从而使它成为一种加富培养基。 (2)利用该分离对象对某种抑菌物质的抗性，在混合培养物中加入该抑制物，经培养后，原来占优势的微生物生长受抑制，而分离对象却可乘机大大增殖，在数量上占优势。,培养基对微生物的选择分析,2选择培养基及应用实例 (1)选择培养基：在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进需要的微生物的生长，目的是从众多微生物中分离所需要的微生物。 (2)选择培养基应用实例： 培养基中加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。 培养基中加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。,培养基中缺乏氮源时，可以分离固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基上生存。 当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果。如石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的。 改变微生物的培养条件，也可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物。,(2015届扬州中学高三月考)科研人员从被石油污染的土壤中分离获得能降解石油成分“多环芳烃菲”的菌株Q，步骤如下图所示，下列相关的叙述中，错误的是( ),A步骤中，培养液中需加入多环芳烃菲作为唯一碳源 B步骤中，将锥形瓶放在摇床上充分振荡，使菌株与培养液充分接触 C步骤是利用平板划线法纯化菌株Q，图中所示接种环最少灼烧2次 D步骤中每一区域可重复画几次，但1区和5区不能出现交叉,解析 要想分离出能降解石油成分“多环芳烃菲”的菌株Q，所用培养液中需加入多环芳烃菲行为唯一碳源，A正确；培养过程中，将锥形瓶充分振荡，目的是使菌株与培养液充分接触，B正确；接种环在每次接种前和接种结束后都通过灼烧来灭菌，所以完成步骤共需灼烧接种环6次，C错误；纯化菌株Q过程中，由于线条末端细菌的数目比线条起始处要少，所以在做第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线，1区和5区不能交叉，D正确。 答案 C,(2015届广州检测)欲从土壤中分离出能分解尿素的细菌，下列实验操作中不正确的是( ) A将土壤用无菌水进行一系列的梯度稀释 B同一浓度的土壤稀释液应至少涂布三个平板 C可将未接种的培养基在相同条件下培养作为对照 D用加入刚果红指示剂的培养基可筛选出分解尿素的细菌 【答案】D,【解析】为了获得单个菌落，应将土壤用无菌水进行一系列的梯度稀释，A正确；为了使结果更加准确，同一浓度的土壤稀释液至少要涂布3个平板进行重复实验，然后计算平均值，B正确；加入刚果红的培养基用来筛选纤维素分解菌，D错误。,
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