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2.2 动物细胞工程,【知识梳理】 一、动物细胞培养 1.操作流程： 组织 单个细胞的悬浮液 _培养 _培养,原代,传代,2.培养条件： (1)无菌、无毒的环境：对_和所有培养用具进行无菌处理， 添加_，定期更换培养液以_。 (2)营养：除正常的有机和无机营养外，加入_等一些 天然成分。 (3)适宜的温度和pH：温度为_(哺乳动物)，pH为 _。 (4)气体环境：含95%空气加_的混合气体，其中后者的作用是 _。 3.应用：生物制品的生产，检测_，医学研究。,培养液,抗生素,清除代谢产物,血清、血浆,36.50.5,7.27.4,5%CO2,维持培养液的pH,有毒物质,二、动物体细胞核移植技术和克隆动物 1.动物核移植：将动物一个细胞的_移入一个已经去掉细胞 核的_中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚 胎最终发育为_。,细胞核,卵母细胞,动物个体,2.过程： 3.原理：动物体细胞核具有_。 4.结果：获得与供体_基本相同的个体。 5.克隆动物：用核移植方法得到的动物。,全能性,供体细胞培养,遗传物质,去核,重组细胞,胚胎移植,供体,三、动物细胞融合 1.原理：_。 2.融合方法：聚乙二醇(PEG)、_、电激等。 3.意义：突破了_的局限，使_成为可能， 也为制造_开辟了新途径。,细胞膜的流动性,灭活的病毒,有性杂交方法,远缘杂交,单克隆抗体,四、单克隆抗体 1.制备过程：,杂交瘤细胞,能分泌所需,抗体,2.优点：特异性强、_，并可大量制备。 3.用途：作为_，用于治疗疾病和_。,灵敏度高,诊断试剂,运载药物,【速记卡片】 1.动物细胞培养过程： (1)分散细胞方法：组织块剪碎，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理。 (2)生长特点：贴壁生长、接触抑制。 (3)分瓶。 (4)原代培养：动物组织消化后的初次培养。 (5)传代培养：分瓶继续培养。,2.动物细胞培养的条件： (1)无菌、无毒的环境。 (2)营养：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、动物血清、血浆等。 (3)温度和pH：与动物体温相近，pH为7.27.4。 (4)气体环境：CO2的主要作用是维持培养液的pH。 3.动物细胞融合： (1)原理：细胞膜的流动性。 (2)融合方法：聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒、电激等。,4.单克隆抗体制备： (1)涉及的三种细胞作用不同。 B淋巴细胞：能分泌单一抗体，但不能无限增殖。 骨髓瘤细胞：能大量增殖，但不能产生抗体。 杂交瘤细胞：既能产生单一抗体，又能大量增殖。 (2)两次筛选的目的不同。 第一次筛选是得到杂交瘤细胞。 第二次筛选是得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。,考点一 植物组织培养、动物细胞培养和细胞核移植 1.三者比较：,2.动物细胞核移植的疑难解析： (1)卵母细胞选择时期及原因：M中期的卵母细胞，此时具备受精能力，细胞质中合成与分裂、分化有关的物质能刺激融合后重组细胞进行分裂分化，形成重组胚胎。 (2)选卵细胞作为受体细胞的原因。 卵细胞大，易于操作。 卵黄多，营养丰富，为发育提供充足的营养。 能激发重组细胞分裂分化。,(3)供体细胞：取供体动物的体细胞培养，一般选用传代10代以内的细胞，因为10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型，保证了供体细胞正常的遗传基础。 (4)动物体细胞不能经培养直接发育成完整个体的原因：动物体细胞的全能性受到限制。 (5)该过程用到的技术手段：动物细胞培养、动物细胞融合、早期胚胎培养和胚胎移植。,【高考警示】动物细胞培养和核移植技术的理解误区 (1)动物细胞培养中两次使用胰蛋白酶的作用不同：第一次用胰蛋白酶处理剪碎的组织使之分散成单个细胞，第二次使贴壁细胞从瓶壁上脱落下来。 (2)核移植产生的克隆动物与提供细胞核的亲本可能不同。 克隆动物细胞质基因来源于另一个亲本，与植物组织培养不同(来自一个亲本)，即克隆动物遗传物质来自两个亲本。 在发育过程中可能发生基因突变、染色体变异导致性状改变。 外界环境条件的影响引起不可遗传的变异。,【考题回访】 1.(2015银川模拟)回答下列有关动物细胞培养的问题： (1)在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面_ 时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的 。 此时，瓶壁上形成的细胞层数是 。要使贴壁的细胞从瓶壁上 分离下来，需要用酶处理，常用的酶是 。,(2)随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现 的现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有 些细胞会因遗传物质发生改变而变成 细胞，这种细胞 的黏着性 ，细胞膜表面蛋白质(糖蛋白)的量 。 (3)用某种大分子染料对细胞进行染色时，观察到死细胞被染色， 而活细胞不染色，原因是_ _。,(4)检查某种有毒物质是否能改变细胞染色体的数目，最好选用分裂到 期的细胞用显微镜进行观察。 (5)在细胞培养过程中，通常在 条件下保存细胞。因为在这种条件下，细胞中 的活性降低，细胞新陈代谢的速率降低。 (6)给患者移植经细胞培养形成的皮肤后，发生了排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤当作 进行攻击。,【解题指南】解答本题需明确三个方面： (1)细胞贴壁生长与接触抑制。 (2)胰蛋白酶和糖蛋白的作用。 (3)器官移植与排斥反应。,【解析】(1)在动物细胞培养过程中，细胞会表现出接触抑制现象，此时是单层细胞。用胰蛋白酶处理可以使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来。 (2)随着细胞传代培养代数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现衰老甚至死亡的现象，但极少数细胞可以连续增殖，有些细胞会因遗传物质改变而变成不死性细胞，这种细胞细胞膜表面糖蛋白减少，细胞黏着性降低。 (3)由于活细胞的膜具有选择透过性，大分子染料不能进入活细胞内，而死细胞的细胞膜丧失了选择透过性，大分子染料能够进入死细胞内而着色。,(4)由于细胞分裂中期染色体形态固定、数目清晰，因此最好选用分裂到中期的细胞用显微镜观察染色体数目。 (5)由于在冷冻、超低温或液氮条件下，细胞中酶的活性降低，细胞新陈代谢的速率降低，通常在此条件下保存细胞。 (6)机体把移植的皮肤当作抗原攻击，会发生排斥现象。,答案：(1)相互接触 接触抑制 单层(或一层) 胰蛋白酶 (2)衰老甚至死亡 不死性 降低 减少 (3)活细胞的膜具有选择透过性，大分子染料不能进入活细胞内，故活细胞不能着色(或死细胞的膜丧失了选择透过性，大分子染料能够进入死细胞内而着色) (4)中 (5)冷冻(或超低温、液氮) 酶 (6)抗原,2.(2015安徽名校联考)如图所示是利用现代生物工程技术治疗遗传性糖尿病(基因缺陷导致胰岛B细胞不能正常合成胰岛素)的过程设计图解，请据图回答下列问题：,(1)图中、所示的结构分别是 、 。 (2)图中、所示的生物工程技术分别是 、 ，此外图示过程还应用的工程技术有_(只需写一种)。 (3)过程通常用去核卵母细胞做受体细胞的原因除了它体积大、 易操作外，还因为 。,(4)过程通常用作受体细胞的原因是这些细胞没有分化， 具有 ，可以定向诱导分化成各类细胞、组织和器官。 (5)过程的完成需要用到的基因操作工具有 。 (6)图示方法与一般的异体移植相比最大的优点是 。,【解析】图中依次为细胞核、内细胞团、核移植技术、转基因技术。图中涉及的技术包括核移植技术、早期胚胎培养(动物细胞培养)、转基因技术、胚胎干细胞移植等。,答案：(1)细胞核 内细胞团 (2)核移植技术 转基因技术 细胞培养(早期胚胎培养、胚胎干细胞移植、显微操作技术等) (3)营养物质丰富且含有促进细胞核全能性表达的物质 (4)全能性 (5)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和载体 (6)没有排斥反应,【加固训练】现有A和B两个肉牛品种，A品种牛的细胞组成可表示为 A细胞核、A细胞质，B品种牛则为B细胞核、B细胞质。 (1)如果要获得一头克隆牛，使其细胞由A细胞核和B细胞质组成，基 本步骤是：从A品种牛体内取出体细胞，进行体外培养，然后再从培 养细胞中取出 注入B品种牛的 卵母细胞，经过某种 刺激和培养后，可形成胚胎，该胚胎被称为 ，将该胚胎移 入代孕母牛的 中，通过培育可达到目的。,(2)克隆牛的产生说明 具有全能性。克隆牛的性状主要表现 品种牛的特征。由A、B两品种牛杂交得到的牛与克隆牛相 比，杂交牛细胞核的遗传物质来自 个亲本，细胞质来自 性亲本，克隆牛和杂交牛的遗传物质组成 (填“相 同”或“不同”)。,【解析】(1)依据题意可知，要获得由A细胞核和B细胞质组成的重组细胞，就要提取A细胞核然后与去掉细胞核的B细胞质进行重组，得到重组细胞，进一步培养得到重组胚胎，再进行胚胎移植，移植到代孕母牛的子宫里进行培育。 (2)克隆动物利用的是动物细胞细胞核的全能性，得到的新个体的性状主要由细胞核决定，与供核母牛的性状基本一致，杂交牛是由精子和卵细胞融合得到受精卵，细胞核来自两个亲本，由于精子含有很少的细胞质，受精卵的细胞质主要来自卵细胞，所以杂交牛和克隆牛的遗传物质是不同的。,答案：(1)细胞核 去核 重组胚胎 子宫 (2)动物体细胞核 A 两 雌 不同,考点二 动物细胞融合、单克隆抗体 1.植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较：,2.单克隆抗体的制备：,【高考警示】植物体细胞杂交和动物细胞融合过程中所选酶和结果的辨析 (1)植物体细胞杂交与动物细胞融合中酶的作用对象不同，纤维素酶和果胶酶作用于细胞壁，而胰蛋白酶作用于细胞间的蛋白质。 (2)植物杂交细胞在激素诱导下能表达出全能性，但动物杂交细胞的全能性不能表达。 (3)取相应B淋巴细胞前必须先注射相应抗原，否则不能获得单克隆抗体。,【考题回访】 1.(2014新课标全国卷)某研究者用抗原(A)分别免疫3只同种小鼠(X、Y和Z)，每只小鼠免疫5次，每次免疫一周后测定各小鼠血清抗体的效价(能检测出抗原抗体反应的血清最大稀释倍数)，结果如图所示。若要制备杂交瘤细胞，需取免疫后小鼠的B淋巴细胞(染色体数目40条)，并将该细胞与体外培养的小鼠骨髓瘤细胞(染色体数目60条)按一定比例加入试管中，再加入聚乙二醇诱导细胞融合，经筛选培养及抗体检测，得到不断分泌抗A抗体的杂交瘤细胞。,回答下列问题： (1)制备融合所需的B淋巴细胞时，所用免疫小鼠的血清抗体效价需达 到16 000以上，则小鼠最少需要经过 次免疫后才能有符合 要求的。达到要求后的X、Y、Z这3只免疫小鼠中，最适合用于制备B 淋巴细胞的是 小鼠，理由是 。,(2)细胞融合实验完成后，融合体系中除含有未融合的细胞和杂交 瘤细胞外，可能还有_ ，体系中出现多种类型细胞的原因是_ _。 (3)杂交瘤细胞中有 个细胞核，染色体数目最多是 条。 (4)未融合的B淋巴细胞经多次传代培养后都不能存活，原因 是 。,【解题指南】 (1)题干关键词：“效价”“杂交瘤细胞”“传代培养”。 (2)隐含信息：柱形图中效价越高，能检测出抗原抗体反应的血清最大稀释倍数越大，说明免疫后小鼠的B淋巴细胞产生抗体的能力越强。 (3)关键知识：制备单克隆抗体的技术流程和动物细胞体外培养的过程。,【解析】本题考查制备单克隆抗体的相关知识。 (1)据图中数据分析，第四次注射后Y、Z小鼠的血清抗体效价均达到16 000以上，免疫后小鼠Y的B淋巴细胞产生抗体效价最高，最适用于制备单克隆抗体。 (2)B淋巴细胞与骨髓瘤细胞混合在一起融合时，可能发生B淋巴细胞之间的融合，骨髓瘤细胞之间的融合和B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，故体系中会出现多种类型的细胞。,(3)杂交瘤细胞形成后，小鼠的B淋巴细胞核与其骨髓瘤细胞核会融合形成一个细胞核。染色体可达100条，有丝分裂后期染色体数目最多为200条。 (4)未融合的B淋巴细胞经多次传代培养后，仍然不是能恶性增殖的细胞，分裂次数是有限的。,答案：(1)四 Y Y小鼠的抗体效价最高 (2)B淋巴细胞相互融合形成的细胞，骨髓瘤细胞相互融合形成的细胞 细胞融合是随机的，没有特异性且融合率达不到100% (3)1 200 (4)不能无限增殖,2.(2015潍坊模拟)人绒毛膜促性腺激素(HCG)是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，制备抗HCG单克隆抗体可用于早孕的诊断。如图是抗HCG单克隆抗体制备流程示意图，请分析回答问题。,(1)制备单克隆抗体过程中要用到 和 技术。 (2)制备单克隆抗体过程中，给小鼠注射的HCG相当于 ， 使小鼠产生分泌相应 的淋巴细胞，此过程属于特异性免 疫中的 免疫。,(3)在细胞内DNA的合成一般有两条途径，主要途径是在细胞内由糖 和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，而氨基嘌呤可以阻断此途径。 另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经酶的 催化作用合成DNA，而骨髓瘤细胞的DNA合成没有此辅助途径。 利用DNA合成途径不同的特点配制的HAT培养基含有多种成分，其 中添加的 具有筛选杂交瘤细胞的作用。 最终筛选获得的杂交瘤细胞的特点是 。 (4)此过程生产的单克隆抗体可以与_ 特异性结合，从而诊断早孕。,【解题指南】解答本题的关键： (1)明确单克隆抗体的制备过程。 (2)熟知在培养基中能够生长增殖的细胞是具有DNA复制途径的细胞。,【解析】(1)制备单克隆抗体过程中要用到动物细胞培养和动物细胞融合技术。(2)给小鼠注射HCG，使小鼠进行体液免疫，产生能分泌抗体的B淋巴细胞。(3)骨髓瘤细胞的DNA合成只有一条途径，在培养基中加入氨基嘌呤，阻断了骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞融合体的增殖。杂交瘤细胞有两条合成DNA的途径，因此在选择培养基上杂交瘤细胞能生存并无限增殖。B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生单一抗体。(4)此单克隆抗体是针对人绒毛膜促性腺激素(HCG)作抗原产生的，可以与人绒毛膜促性腺激素(HCG)特异性结合。,答案：(1)动物细胞培养 动物细胞融合 (2)抗原 抗体 体液 (3)氨基嘌呤 能无限增殖并分泌特异性抗体 (4)人绒毛膜促性腺激素(或HCG),【延伸探究】题中(3)经过氨基嘌呤处理后，能够存活的细胞类型有哪些？ 提示：由于骨髓瘤细胞没有DNA合成的辅助途径，而氨基嘌呤阻断主要途径，所以经处理后，能够存活的细胞是B淋巴细胞和B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后的细胞。,【加固训练】如图为制备单克隆抗体和多克隆抗体的示意图，据图回答下列问题：,(1)图中向小鼠注射包含多种抗原决定簇的抗原后，所获得的免疫 抗血清实际上是含有 (填写抗体的名称)的混合 物，这种方法制备的多克隆抗体不仅产量低、而且纯度低。 (2)图中选用B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，说明细胞 膜具有 ，如果仅考虑细胞的两两融合，其融合细胞有 种类型。,(3)图中两次筛选的目的不同，其中筛选的目的是筛选出 ，筛选的目的是筛选出 。 (4)科学工作者正在研究的用于治疗癌症的“生物导弹”就 是 。用“生物导弹”治疗癌症的方法优 于化疗的原因是_ _。,【解析】(1)结合题图可看出获得的免疫抗血清实际上是Ab1、Ab2、Ab3、Ab4多种抗体的混合物。 (2)动物细胞融合的过程体现了细胞膜的流动性；仅考虑两个细胞的融合，可得到B淋巴细胞+B淋巴细胞、骨髓瘤细胞+骨髓瘤细胞及B淋巴细胞+骨髓瘤细胞3种类型的融合细胞。 (3)在单克隆抗体的制备过程中，筛选的目的是筛选出杂交瘤细胞，筛选的目的是获得能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。,(4)把单克隆抗体跟抗癌药物相结合制成“生物导弹”，注入患者体内，借助单克隆抗体的导向作用，能将药物定向带到癌细胞所在位置，在原位杀死癌细胞。这样既不损伤正常细胞，又减小了用药剂量，而且疗效高、毒副作用小。 答案：(1)Ab1、Ab2、Ab3、Ab4 (2)流动性 3 (3)杂交瘤细胞 能分泌所需抗体的杂交瘤细胞 (4)单克隆抗体上连接抗癌药物 可以原位杀死癌细胞，还不损伤正常细胞，且用药剂量小，疗效高、毒副作用小,
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