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DNA的粗提取与鉴定,问题1：构成生物体的主要遗传物质是什么？,问题2：如何证明它是遗传物质？,问题3：怎样才能将细胞内的这些物质分离出来？,基础知识,1、提取生物大分子的基本思路 选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子,2、提取DNA的基本思路 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分,一、提取DNA的原理,1、DNA的溶解性 DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,根据DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下，DNA的溶解度最小？ DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？,如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？,、DNA在酒精溶液中的溶解性 DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离,一、提取DNA的原理,2、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响 大多数蛋白质不能忍受6080度的高温，而DNA在80度以上才会变性 洗涤剂可以瓦解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质,但对DNA没有影响,一、提取DNA的原理,3、DNA的鉴定： DNA与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂,二、实验设计,1、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取23种实验材料） 2、原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大,（一）实验材料的选取,本节课以鸡血细胞为例来讲述DNA的粗提取与鉴定,二、实验设计,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,思考：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？,使鸡血细胞吸水涨破，释放DNA,思考：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？,洗涤剂含一些离子去污剂，能瓦解细胞膜，有利于DNA的释放,食盐的主要成分是氯化钠，有利于DNA的溶解,思考：如果研磨不充分，会对实验产生怎样的影响？,DNA释放不完全，提取的DNA偏少，二苯胺鉴定颜色不明显,二、实验设计,讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？,可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质,（三）去除滤液中的杂质,-这是实验成功的关键,（四）DNA析出与鉴定,三、实例：用鸡血细胞液提取DNA并鉴定,1.制备鸡血细胞液：,在鸡血中加入质量浓度为01g/mL的柠檬酸钠溶液，离心或静置处理；除去血浆，留鸡血细胞备用。,思考：加入柠檬酸钠的作用是什么？,防止血液凝固,2.提取鸡血细胞的细胞核物质：,向鸡血细胞液中加入蒸馏水，用玻璃棒沿一个方向快速搅拌5min、用3-4层纱布过滤，取其滤液。,思考：如果是植物细胞，如何获取植物细胞的核物质？,去梗、剪碎、加洗涤剂和食盐，充分研磨，过滤收集滤液,三、实例：用鸡血细胞液提取DNA并鉴定,3. 溶解细胞核内的DNA：,加入2mol/L的氯化钠溶液，用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌，使DNA呈溶解状态。,4析出含DNA的黏稠物：,沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现。当黏稠物不再增加时时停止加入蒸馏水。,思考：此时加入蒸馏水的目的是什么？,降低氯化钠溶液的浓度，析出DNA,三、实例：用鸡血细胞液提取DNA并鉴定,5. 滤取含DNA的黏稠物：,用3-4层纱布过滤，取纱布上的黏稠物。,6. 将DNA的黏稠物再溶解：,加入2mol/L的氯化钠溶液，沿一个方向轻轻搅拌，使DNA呈溶解状态。,7. 过滤含有DNA的氯化钠溶液：,用放有2层纱布的漏斗过滤以上溶液，取其滤液。,三、实例：用鸡血细胞液提取DNA并鉴定,答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质,三、实例：用鸡血细胞液提取DNA并鉴定,8. 提取含杂质较少的DNA：,在上述滤液中，加入冷却的、体积分数为95的酒精溶液50 mL，并用玻棒沿一个方向搅拌，当玻棒上的丝状物不再增加时，卷起丝状物，用滤纸吸取上面的水分。,思考：为什么加入的酒精需要冷却的？,一是抑制核酸水解酶的活性，防止DNA降解； 二是降低分子运动，易于形成沉淀析出； 三是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂,思考：95%的酒精的作用是什么？,凝集DNA，溶解细胞中其他物质，提纯DNA,9. DNA的鉴定：,三、实例：用鸡血细胞液提取DNA并鉴定,取两支的试管，各加入物质的量浓度为0.015mol/L的氯化钠溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4 mL的二苯胺试剂。将试管置于沸水中加热5min，等试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。,2次,3次,第1次和第三次取滤液，第二次取黏稠物,始终沿一个方向 除第一次外，其余都要轻轻搅拌，防止DNA断裂,总结,
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