基因工程的原理和技术.ppt

利用基因工程原理让大肠杆菌生产人胰岛素又需要哪些基本操作步骤呢？,第二节 基因工程的原理和技术,基因工程（将人胰岛素基因转入大肠杆菌）,胰岛素基因,人体细胞,大肠杆菌,随细菌的增殖，胰岛素基因也同时复制,胰岛素,获取胰岛素基因的表达产物胰岛素,形成重组DNA分子,导入 受体细胞,目的基因 检测与鉴定,获取 目的基因,基因工程的基本操作步骤（技术）,1、筛选含有目的基因的受体细胞,2、目的基因的表达,问题：获取目的基因的方法有哪些？,思考1：如果我们对目的基因的碱基序列完全未知，比如:如果我们对抗虫基因的碱基序列完全不知道，怎样从苏云金芽孢杆菌体内获取目的基因（抗虫基因）？ 如何操作？,大片段DNA,打成许多小片段,小片段DNA,目的基因,载入运载体,细菌,重组DNA分子,重组DNA分子,例如：从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫蛋白的基因,如果运气不好，在打成小片段时，有可能把抗虫基因打断,如何从基因文库中获取目的基因?,大片段DNA,打成许多小片段,小片段DNA,目的基因,载入运载体,细菌,重组DNA分子,重组DNA分子,基因组文库,对基因组文库的所有细菌进行逐一筛查 找出有抗虫蛋白的菌落 该菌落所携带的基因片段就含有目的基因,例如：从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫蛋白的基因,容易吗？,构建基因组文库，获取目的基因,一.基因工程的基本操作步骤（技术）,(一)获得目的基因,生物材料,DNA,提取,限制酶,DNA片段,形成重组DNA分子,导入,受体菌群体,构建,基因组文库,1.从基因文库中获取,思考：从基因组文库中获取人的胰岛素基因，导入大肠杆菌能否成功表达？为什么？,思考： 能否根据mRNA合成没有内含子的胰岛素基因？,单链RNA （mRNA),逆转录酶,杂交双链,核酸酶H,单链DNA,DNA聚合酶,双链DNA,逆（反）转录法合成目的基因：,cDNA文库的构建,水解RNA,一.基因工程的基本操作步骤（技术）,(一)获得目的基因,生物材料,DNA,提取,限制酶,DNA片段,形成重组DNA分子,导入,受体菌群体,构建,基因组文库,mRNA,目的基因 (cDNA),形成重组DNA分子,导入,受体菌群体,构建,cDNA 文库,1.从基因文库中获取,思考：基因文库如同国家图书馆，而cDNA文库则像某单位的图书馆，二者除了大小不同之外，还有哪些区别？,小,大,无,有,无,有,部分基因,全部基因,思考： 如果想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，需要构建哪一种基因文库？,问题：获取目的基因的方法有哪些？,思考1：如果我们对目的基因的碱基序列完全未知，怎样办？如何操作？ 思考2：如果我们已知目的基因的碱基序列，可以怎样操作？,一.基因工程的基本操作步骤（技术）,(一)获得目的基因,生物材料,DNA,提取,限制酶,DNA片段,导入,受体菌群体,构建,基因组文库,mRNA,反转录,目的基因 (cDNA),导入,受体菌群体,构建,cDNA 文库,目的基因的核苷酸序列是已知,化学合成法,目的基因,1.从基因文库中获取,2.化学合成法,提取,形成重组DNA分子,形成重组DNA分子,问题：获取目的基因的方法有哪些？,思考1：如果我们对目的基因的碱基序列完全未知，怎样办？如何操作？ 思考2：如果我们已知目的基因的碱基序列，可以怎样操作？ 思考3： 如果我们已知蛋白质的氨基酸序列，又可以怎样操作？,思考：能否根据氨基酸的序列获得人胰岛素基因的碱基序列？,化学合成法,一.基因工程的基本操作步骤（技术）,(一)获得目的基因,生物材料,DNA,提取,限制酶,DNA片段,形成重组DNA分子,导入,受体菌群体,构建,基因组文库,mRNA,反转录,目的基因 (cDNA),形成重组DNA分子,导入,受体菌群体,构建,cDNA 文库,目的基因的核苷酸序列是已知,化学合成法,目的基因,1.从基因文库中获取,2.化学合成法,提取,或可推测的,问题：获取目的基因的方法有哪些？,思考1：如果我们对目的基因的碱基序列完全未知，怎样办？如何操作？ 思考2：如果我们已知目的基因的碱基序列，可以怎样操作？ 思考3： 如果我们已知蛋白质的氨基酸序列，又可以怎样操作？ 思考4：如果我们知道目的基因两端的部分碱基序列，还可以怎样操作？,聚合酶链式反应（PCR技术）,变性：双链DNA解链成为单链DNA 复性（退火）：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链,1.变性 升温至95,2.复性 降温至60,引物与母链结合,3.延伸 升温至72,DNA聚合酶,解旋,PCR技术与原理,Taq DNA聚合酶有耐高温的特点,思考：PCR技术扩增目的基因，需要什么前提和条件？过程如何？原理是什么？,聚合酶链式反应(PCR技术)扩增,原理：,目的：,前提：,条件：,DNA复制,获得大量的目的基因,有一段已知目的基因（两端）的核苷酸序列,以便根据这一序列合成引物。,模板DNA（目的基因）,耐高温DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶),四种脱氧核苷酸,两种DNA引物,一.基因工程的基本操作步骤（技术）,(一)获得目的基因,生物材料,DNA,提取,限制酶,DNA片段,形成重组DNA分子,导入,受体菌群体,构建,基因组文库,mRNA,反转录,目的基因 (cDNA),形成重组DNA分子,导入,受体菌群体,构建,cDNA 文库,目的基因的核苷酸序列是已知,化学合成法,3.利用PCR技术扩增,目的基因,1.从基因文库中获取,2.化学合成法,提取,获取大量目的基因,或可推测的,最快第几轮能得到目的基因？,DNA分子,目的基因,解旋酶,高温（加热至95）,RNA引物,DNA引物,解旋酶、DNA聚合酶等,TaqDNA聚合酶,人工基因合成法,DNA合成仪,PCR扩增仪,一.基因工程的基本操作步骤（技术）,(一)获得目的基因,问题：怎样将目的基因与质粒进行重组？,质粒,目的基因,限制酶,同一种限制酶切割,质粒,外源基因,重组DNA分子 （重组质粒）,DNA连接酶,问题2：形成的重组质粒导入受体细胞后，除了能够稳定存在外，并且可以遗传给下一代。同时，使目的基因在受体细胞中表达和发挥作用，需要对重组质粒作怎样的修饰？,据图回答：一个表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有哪些基本元件？,(二)形成重组DNA分子（构建基因表达载体),基因表达载体的组成,启动子,目的基因,终止子,复制起点,标记基因,一.基因工程的基本操作步骤（技术）,(一)获得目的基因,通常用同一种限制酶切割目的基因和载体(质粒)，形成相同的粘性末端，再用DNA连接酶将二者连接,形成重组DNA分子（基因表达载体）。,用BamH对胰岛素基因和质粒切割，加入DNA连接酶，得到的都是重组质粒吗？,双酶切连接：,思考：如何 避免质粒和目的基因的自身环化？,1、避免载体和目的基因的自身环化、载体和目的基因间反向连接 2、提高重组DNA分子的重组率,(三)将目的基因导入受体细胞,(二)形成重组DNA分子（构建基因表达载体),一.基因工程的基本操作步骤（技术）,(一)获得目的基因,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将细菌用CaCl2处理，使细胞处于感受态，可促进细胞吸收DNA分子,如果是导入微生物（如细菌）,感受态：细胞处于容易吸收外源性DNA的状态。 处于感受态的细胞称为感受态细胞.,CaCl2,0,重组载体,感受态细胞,42,如果是导入微生物（如细菌）,(三)目的基因导入受体细胞,1. 转基因微生物,重组DNA分子 (基因表达载体),CaCl2处理,感受态细菌细胞 (工程菌),目的基因随受体细胞的繁殖而复制,增大细胞壁通透性,(二)形成重组DNA分子（构建基因表达载体),一.基因工程的基本操作步骤（技术）,(一)获得目的基因,吸收DNA分子,重组 DNA进入细菌细胞,如果是导入动物细胞,显微注射仪,受精卵,思考： 培育转基因动物时，受体细胞能否采用动物体细胞？试说明理由。一般可以采用动物的什么细胞？,用口径为1m的DNA注射器，将大量的目的基因片段注入到受精卵的核内，然后把经过注射的受精卵移植到另一只雌性动物的子宫内，使受精卵发育为转基因动物。,(三)目的基因导入受体细胞,1. 转基因微生物,重组DNA分子 (基因表达载体),CaCl2处理,感受态细菌细胞 (工程菌),目的基因随受体细胞的繁殖而复制,增大细胞壁透性,2. 转基因动物,重组DNA分子,显微注射,受精卵或早期胚胎细胞(整合到染色体DNA上),转基因动 物,动物细胞培养,胚胎移植,(二)形成重组DNA分子（构建基因表达载体),一.基因工程的基本操作步骤（技术）,(一)获得目的基因,吸收DNA分子,重组 DNA进入细菌细胞,或病毒侵染,思考： 1、如果是导入植物细胞，最好以什么细胞为受体细胞？一般采用的运载体又是什么？ 2、比如：培育抗虫棉，怎样操作才能成功导入？,农杆菌转化法,农杆菌的Ti质粒T-DNA：(可转移的DNA） 可转移（也可以将目的基因转移）至受体细胞中，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。,农杆菌转化法,3. 转基因植物,重组DNA分子,农杆菌,植物体细胞(整合到细胞染色体DNA上),侵染,植物组织培养,转基因植物,农杆菌转化法,利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒（有钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.64um）表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。 这是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本太高。,基因枪,花粉管,卵细胞,花粉管通道法,受精后,花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,3. 转基因植物,重组DNA分子,农杆菌,植物体细胞(整合到细胞染色体DNA上),侵染,植物组织培养,转基因植物,基因枪或 花粉管通道法,农杆菌转化法,(三)目的基因导入受体细胞,(二)形成重组DNA分子（构建基因表达载体),一.基因工程的基本操作步骤（技术）,(一)获得目的基因,(四)目的基因的检测与鉴定,问题1：根据中心法则，目的基因怎样表达？成功表达的标志是什么？,按照基因表达顺序逐步检测，逐步过关,如何检测 ？,思考：通常为什么要选用含有两个标记基因的运载体？,没有质粒,含目的基因的质粒,正常质粒,没有质粒,含目的基因的质粒,正常质粒,DNA分子杂交法检测目的基因,DNA分子杂交法,制作方法：,化学合成或PCR法合成,特点：,1.被放射性同位素标记,2.目的基因片段,3.单链DNA,原理：,碱基互补配对，检测未知DNA分子,用途：,目的基因检测,DNA指纹,亲缘关系测定, 基因诊断。,DNA分子探针法,检测转基因生物体内是否已含有目的基因,同理： 核酸分子杂交技术,按照基因表达顺序逐步检测，逐步过关,思考：受体细胞摄入目的基因后就说明目的基因完成了表达吗？,检测目的基因是否已转录出了mRNA,检测转基因生物体内是否已含有目的基因,检测目的基因是否已转录出了mRNA,检测目的基因是否已翻译出了蛋白质,利用抗原-抗体的特异性结合,按照基因表达顺序逐步检测，逐步过关,问题：如何运用抗原抗体特异性结合的原理检测目的基因是否翻译出了蛋白质？,检测目的基因是否已翻译出了蛋白质,利用抗原-抗体的特异性结合,将目的基因表达出的蛋白质作为抗原,制备抗体,检测个体是否具有目的基因所对应表现型,按照基因表达顺序逐步检测，逐步过关,问题： 除了上述分子检测外，你能否在个体生物学水平上进行检测？例如，如何检测转基因抗虫棉具有抗虫特性？,转基因 抗虫植物,用棉花叶片饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,(四)目的基因的检测与鉴定,1.目的基因是否导入：,(1)标记基因检测法。,(2)DNA分子杂交法(DNA探针检测法),2.目的基因是否表达：,(3)是否出现目的基因所控制的性状:,(2)是否翻译合成了蛋白质：,抗原抗体杂交检测法,核酸分子杂交法,（1）是否转录出了信使RNA：,观察法,基因工程的基本操作程序,基因文库,获取目的基因,基因组文库,cDNA文库,化学合成法,PCR扩增法,运载体（细菌质粒）,酶切、连接，构建,重组DNA（基因表达载体）,受体细胞,导入,筛选,动物受精卵,植物体细胞,细菌细胞,组织培养,发酵工程,胚胎移植,表达产物,转基因动物,转基因植物,目的基因的表达与鉴定,总结：,二.基因工程的原理,1.整体原理：,人工的基因重组,2.各步骤原理：,（1）基因能转移：,基因是独立的遗传单位,（2）不同生物的基因能拼接：,不同生物的DNA有着相同的双螺旋结构和碱基互补配对原则，限制酶和连接酶的作用。,（3）同一基因在不同生物的细胞中合成相同的蛋白质：,复制、转录和翻译过程相同，密码子具有通用性,3.优点：,定向改变生物的遗传特性,例1 科学工作者分离得到了某真核生物的基因A，将其解离成两条具有互补关系的单链，其中的一条与基因A的信使RNA进行配对，杂交后可以观察到如图所示的结构对此结果的合理解释是（ ） A1、3、5、7为DNA/RNA的杂交体，2、4、6为单链DNA部分 B1、3、5、7为DNA/RNA的杂交体，2、4、6为单链RNA部分 C1、3、5、7为双链DNA部分，2、4、6为DNA/RNA的杂交体 D1、3、5、7为单链RNA部分，2、4、6为DNA/RNA的杂交体,A,例2.质粒是基因工程中最常用的运载体，质粒上有标记基因（如图所示），通过标记基因可以推知外源基因（目的基因）是否转移成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同。右图表示外源基因插入位置（插入点有a、b、c），请据下表细菌生长情况，推测三种重组细菌与外源基因插入点相对应的一组是,A是c、是a 、是 b B 是c和b、是b、是c C是c和b、是c、是b D 是a、是b、是c,A,b,c,a,例3.培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（kan）常作为标记基因,只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。下图为获得抗虫棉的技术流程.,抗虫基因,含kan质粒,重组质粒,土壤 农杆菌,含重组质粒土壤农杆菌,A 构建,C 诱导选择,导入,转基因 抗虫植株,再生植株,愈伤组织,离体棉花叶片组织,侵染,B 培养选择,分化,D 检测,（1）A过程需要的酶有 _ 。,（2）B过程及其结果体现了质粒作为运载体必须具备 的两个条件是_ 。,（3）C过程的培养基除含有必要营养物质、琼脂和激素外，还必须加入_。,限制性核酸内切酶和DNA连接酶,能够自我复制、具有标记基因,卡那霉素,4.如果利用DNA分子杂交原理对再生植株进行检测，D过程应该用_作为探针。,5.科学家发现转基因植株的卡那霉素抗性基因的传递符合孟德尔遗传规律。 将转基因植株与_杂交，其后代中抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型的数量比为1：1。 若该转基因植株自交，则其后代中抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型的数量比为_。 若将该转基因植株的花药在卡那霉素培养基上作离体培养，则获得的再生植株群体中抗卡那霉素型植株占_%。,标记的目的基因,非卡那霉素敏感型,3:1,100,例4.科学家将外源目的基因与大肠杆菌的质粒进行重组，并在大肠杆菌中成功表达。下图表示构建重组质粒和筛选含目的基因的大肠杆菌的过程。请据图回答问题,典型例题1：,（1）步骤和中常用的工具酶是和。 （2）图中质粒上有抗氨苄青霉素和抗四环素两个标记基因，经过和步骤后，有些质粒上的基因内插入了外源目的基因，形成重组质粒，由于目的基因的分隔使得该抗性基因失活。 （3）步骤是的过程，为了促进该过程，应该用处理大肠杆菌。 （4）步骤将三角瓶内的大肠杆菌接种到含四环素的培养基C上培养，目的是筛选，能在C中生长的大肠杆菌有种。 （5）步骤：用无菌牙签挑取C上的单个菌落，分别接种到D（含氨苄青霉素和四环素）和E（含四环素）两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于（D、E）上，请在图中相应的位置上圈出来。,答案,（1）限制性核酸内切酶 DNA连接酶 （2）氨苄青霉素抗性基因 （3）将重组质粒（目的基因）导入大肠杆菌（受体细胞） CaCl2溶液 （4）含四环素抗性基因的大肠杆菌（含抗性基因的大肠杆菌给分，回答含目的基因的大肠杆菌不给分） 2 （5）E（评分标准：在两个菌落中圈一个也可给分 ）,把正常基因导入目标细胞，以纠正或补偿基因缺陷，达到治疗的目的。,基因治疗,蛋白质工程：,基因DNA,氨基酸序列多肽链,蛋白质 空间结构,mRNA,转录,翻译,DNA合成,生物功能,预期功能,点突变,分子设计,折叠,原理：,改造基因（基因修饰或基因合成）,目的：,定向改造或制造自然界不存在的 蛋白质 （以满足人类的生产和生活的需求）,第二代基因工程,例：T4溶菌酶,异亮氨酸,半胱氨酸,二硫键的形成提高了T4溶菌酶的热稳定性,