动物产品中马、驴、骡源性成分的定性检测方法　实时荧光PCR法（定稿）

ICS65.020.01B 40DB37山东省地方标准DB 37/T动物产品中马、驴、骡源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法Qualitative detection of horse,donkey and mule derived materials in feed and relative productsReal-time PCR method-发布-实施山东省市场监督管理局 发布DB 37/T 前言本标准按照GB/T 1.12009的规则起草。本标准由山东省市场监督管理局提出、归口并组织实施。本标准起草单位：山东省产品质量检验研究院、青岛朗天科技服务有限公司。本标准主要起草人：王一村、郗丹、李娜、高静静、侯广月、周莉莉、许士明、徐正、才美佳、王诚、康兆广、苏本玉、邹惠玲、张鹏。本标准为首次发布。引言动物相关产品中骡源性成分的检测目前没有国家标准和相关行业标准，且现有的基于实时定量PCR技术的驴、马源性成分鉴定无法排除骡源性成分的干扰。本标准主要适用于动物原材料及动物相关产品的检测，不适用于动物深加工产品（如阿胶及其附属产品）的检测。6动物产品中马、驴、骡源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法1 范围本标准规定了动物原材料及动物相关产品中马、驴、骡源性成分检测方法。本标准适用于动物原材料及动物相关产品的定性检测。本标准不适用于动物深加工产品（如阿胶及其附属产品）的检测，本方法的最低检出限（LOD）为100 mg/kg。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测SN/T 1193基因检测实验室技术要求3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1荧光定量PCR技术在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。3.2Ct值每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。3.3已知来源于单一动物源性成分的样品从肉眼上可判断出其材料来自于同一个生物有机体的样品（如一张皮毛等固定的动物组织）或有证据表明其来源于同一种生物有机体且未经其他源性成分干扰过的样品。4 原理骡为马和驴杂交的后代，含有马和驴的核基因双重遗传背景。利用TaqMan实时荧光PCR技术，根据动物核基因组中编码肌肉肌酸激酶（creatine kinase muscle，ckm）基因上各物种间（尤其是马和驴）基因序列差异而进行动物源性成分鉴定。利用各类方法提取得到高纯度DNA，以提取的DNA为模板进行内参照基因的实时荧光PCR检测，以确定样品DNA的提取效率和PCR反应体系是否满足要求。通过特异性引物和标记荧光物质探针进行马、驴、骡源性成分的荧光PCR扩增，根据PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的强弱判定实现对马、驴、骡源性成分的定性分析。其中，马源性成分应有马的荧光信号，驴源性成分应只有驴的荧光信号，骡源性成分同时含有马和驴的荧光信号。因此，被检样品如检出马源性成分，未检出驴源性成分，可断定样品含有马成分。如检出驴源性成分，未检出马源性成分，可断定样品含有驴成分。如检出马和驴源性成分，且样品为已知来源于单一动物源性成分的样品，可断定样品含有骡成分。5 仪器和设备5.1 电子天平，感量0.01 g。5.2 微量可调移液器（最大量程为10 L、20 L、100 L、1 000 L）。5.3 恒温水浴锅。5.4 磁力搅拌器。5.5 高速冷冻离心机。5.6 二级生物安全柜。5.7 高压灭菌锅。5.8 普通冰箱：4 ，-20 。5.9 pH计。5.10 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。5.11 实时荧光定量PCR仪。6 试剂和材料6.1 试剂的配制及试验中的操作规范应按GB/T 27403和SN/T 1193的规定执行。6.2 除另有规定外，试剂应为分析纯或化学纯级别，实验用水应符合GB/T 6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。6.3 检测用引物和Taqman探针序列（详见表1）。表1 检测用引物和Taqman探针名称序列（53）目的基因内参照5端引物内参照3端引物内参照探针F: 5-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3R: 5-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3P: 5-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-TRAMA-3真核生物18SrRNA基因马成分5端引物马成分3端引物马成分探针F:5-CCTGGTATGGAAACATTGGAATC-3R:5-CTTGGAGAGCGAGCACAGC-3P: 5-FAM-CCGGAAACAAAGTGAG-MGBNFQ-3马核基因组ckm基因驴成分5端引物驴成分3端引物驴成分探针F:5-CCTGGTATGGAAACATCGGAATC-3R:5-CTCGGAGAGCGAGCACAGC-3P: 5-FAM-CCCGACACAAAGTGAG-MGBNFQ-3驴核基因组ckm基因推荐赛默飞世尔科技（中国）有限公司合成的Taqman-MGB探针，或等效试剂。6.4 CTAB缓冲液：55 mmol/L CTAB，1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris，调pH至8.0。121 高压灭菌20 min，备用。6.5 TE缓冲液：10 m mol/L Tris-HCl (pH 8.0)，1 mmol/L EDTA (pH 8.0)。6.6 蛋白酶K：20 mg/L。6.7 RNA 酶溶液：5 g/L。6.8 Tris 饱和酚。6.9 三氯甲烷。6.10 异戊醇。6.11 异丙醇。6.12 70 %乙醇。6.13 商品化2荧光定量PCR预混液：推荐宝日医生物技术（北京）有限公司的Premix Ex Taq、南京诺唯赞生物科技有限公司的AceQ qPCR Probe Master Mix，或等效试剂。7 样品制备应将试样充分粉碎混合均匀后进行DNA的提取。固体样品要充分粉碎研磨，必要时用液氮研磨。8 检验步骤8.1 DNA提取称取0.2 g0.3 g已制备好的样品于2 mL离心管中，加入1 000 L CTAB缓冲液和40 L蛋白酶K，震荡混匀，65 温浴30 min，每隔10 min振荡混匀。12 000 g离心10 min，吸取1 mL上清液至2 mL离心管中，勿吸取管内杂质。向离心管中加入500 L体积比为25:24:1的酚-三氯甲烷-异戊醇的混合液，剧烈震荡，12 000 g离心12 min。吸取上清液至一新离心管中，加入等体积异丙醇，剧烈震荡，12 000 g离心10 min。弃上清液，用65 预热的双蒸水溶解DNA。加入5 L RNA酶，37 温浴30 min。加入200 L体积比为24:1的三氯甲烷-异戊醇混合液，剧烈震荡，12 000 g离心12 min。吸取上清液至一新离心管中，加入等体积异丙醇，震荡均匀，12 000 g离心10 min。弃上清，70 %乙醇洗涤一次，12 000 g离心1 min。弃上清液，晾干后加入50 L TE缓冲液溶解DNA，-20 保存。DNA提取也可使用等效的DNA提取试剂盒替代，推荐南京诺唯赞生物科技有限公司的FastPureTM Tissue DNA Isolation Mini Kit，或等效试剂盒。8.2 DNA浓度及纯度的测定取适量的DNA模板溶液加双蒸水稀释一定倍数后，使用紫外分光光度计测定260 nm和280 nm处的吸光值A260和A280，DNA浓度计算按式（1）计算： C=AN50(1)式中：C DNA浓度，单位为纳克每微升（ng/L）；A 260 nm处的吸光值；N 核酸稀释倍数；50吸光值A260为1时，相对应双链DNA的浓度常数。当A260/A280比值在1.82.0之间时，DNA模板适宜荧光定量PCR扩增。若检测DNA模板浓度不在规定范围内，可适当增加样品采样量或增加荧光定量PCR反应过程中模板量或减少溶解DNA的溶剂的量，提高浓度，以保证检测的有效性。8.3 实时荧光PCR检测8.3.1 实时荧光PCR反应体系实时荧光PCR反应体系见表2。表2 实时荧光PCR反应体系试剂成分体积（单位：L）2荧光定量PCR预混液引物F（10 M）引物R（10 M）探针P（5 M）样品DNA（10 ng/L100 ng/L）ddH2012.51111补至 258.3.2 实时荧光PCR反应参数95 预变性5 min；95 变性 5 s，60 退火30 s，45个循环。8.3.3 实验对照检验过程中分别设内参照、马源性阳性对照、驴源性阳性对照、阴性对照、空白对照。以任一真核生物提取的DNA为内参照、以马提取的DNA为马源性阳性对照、以驴提取的DNA为驴源性阳性对照、以已知不含有马、驴、骡成分的样品提取的DNA为阴性对照，以灭菌水为空白对照。所有反应均设置两个平行反应体系。9 质量控制以下条件有一条不满足时，实验视为无效，需重新进行实验：a) 空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值40.0；b) 阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值40.0；c) 马源性阳性对照：有荧光对数增长且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值30.0；d) 驴源性阳性对照：有荧光对数增长且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值30.0；e) 内参照：有荧光对数增长且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值30.0。10 结果判定及表述10.1 结果判定在符合第9部分的情况下，被检样品进行检测时：a) 如马源性Ct值35.0，则判定为被检样品马源性成分阳性；b) 如驴源性Ct值35.0，则判定为被检样品驴源性成分阳性；c) 如Ct值40.0，则判定相应被检源性成分阴性；d) 如35.0Ct值40.0，判为结果可疑，需要重新检测。重新检测需从提取DNA开始重新检测，由于为定性检测，可从多个方面提高检测率，根据各种具体情况在可选使用量的几个因素中重新调整优化检测过程，如增加样品取样量、减少溶解DNA的TE剂量，增加PCR反应中加入的模版量、适量增加PCR反应循环数等。如再次扩增后Ct值仍为40.0，则判定相应被检成分阳性；如再次扩增后Ct值40.0，则判定相应被检成分阴性。荧光定量PCR扩增的马和驴DNA序列参见附录A。10.2 结果表述10.2.1 结果为马源性成分阳性且驴源性成分阴性者，表述为“检出马成分”。10.2.2 结果为驴源性成分阳性且马源性成分阴性者，表述为“检出驴成分”。10.2.3 结果为马和驴源性成分阳性者，表述为“检出马和驴源性成分”，如样品为已知来源于单一动物源性成分的样品，可表述为“检出骡成分”。 10.2.4 结果为马和驴源性成分阴性者，表述为“未检出马、驴、骡成分”。11 防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T 27403中的规定执行。AA附录A （资料性附录）扩增产物序列A.1 马ckm基因实时荧光PCR扩增的DNA序列（93bp）F P1 CCTGGTATGG AAACATTGGA ATCAGCGCCG GAAACAAAGT GAGCTCTCGG GACCTGACAG61 GGGGTGCTAT TGGTGCTGTG CTCGCTCTCC AAGRA.2 驴ckm基因实时荧光PCR扩增的DNA序列（93bp）F P1 CCTGGTATGG AAACATCGGA ATCAGCGCCC GACACAAAGT GAGCTCTCGG GACCTGACAG61 GGGGTGCTAT TGGTGCTGTG CTCGCTCTCC GAGR_