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实验三、外周血细胞基因组 DNA的提取 (NaI法),1,基因组DNA提取原理,Loparev等报道利用NaI提取DNA的方法,从全血制备白细胞DNA,可用双蒸水溶涨红细胞及白细胞膜,释放出血红蛋白及细胞核。加NaI破核膜并使DNA从核蛋白中解离,用氯仿/异戊醇抽提使蛋白质沉淀完全(异戊醇去泡沫),DNA存在于上层水相中,以异丙醇沉淀 DNA,离心弃去异丙醇,并重复操作一次,即可获得白细胞DNA。,2,氯仿/异戊醇:使蛋白变性。 氯仿的作用是蛋白变性剂、抽提脂溶性物质; 异戊醇作用是A.降低表面张力、阻止气泡的产生(剧烈震荡时容易产生气泡,气泡会阻止相互间的充分作用);B.有助于分相(使离心后水相、有机相稳定) 异丙醇:沉淀DNA 70%乙醇:洗涤DNA; (盐、蛋白等溶于70%乙醇,而DNA不溶) 100%乙醇:可以用于沉淀DNA,也可以用于使DNA快速干燥,3,限制性核酸内切酶作用原理,限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列(48bp),并对其进行切割的核酸内切酶。,4,PCR反应原理,基于DNA的半保留复制,两条链都可以作为模板。在体内,DNA复制是周期性的,所以基因扩增的数量有限;PCR技术在体外利用人工合成的引物,再加上DNA聚合酶和一些合适的底物和因子,通过对温度的控制,使DNA不断位于变性、复性和合成的循环中,达到扩增DNA的目的。,5,PCR反应反复进行三步骤的循环过程: 热变性退火引物延伸 1)热变性:基因组DNA在95 下加热5分,双螺旋结构被热变性解链为两股单链。 2)退火:将反应混合物降温至5565,引物与上述单链DNA上互补的序列杂交在一起,即退火,形成模板引物复合。 3)引物延伸:将反应混合物调节至72,在DNA聚合酶作用下,以dNTP为原料,从引物3端开始,沿着53的方向,按照模板链的序列,合成一条新DNA链,其序列与模板序列互补。,6,7,8,器具和试剂,离心机、振荡器、Eppendorf管,移液器等 抗凝人外周血,双蒸水,6M NaI溶液,氯仿/异戊醇,70乙醇,TE溶液,9,试剂,抗凝人外周血,双蒸水,6M NaI溶液,氯仿/异戊醇,70乙醇,TE溶液,10,步骤,1取外周抗凝血(全血)200ul 于Eppendorf管中,12000rpm离心12min。 2. 弃上清,加双蒸水200ul 溶解,摇匀20s。混匀后加6M NaI溶液200ul,充分摇匀20s。 3. 加入氯仿/异戊醇(24:1)400ul,边加边摇,摇匀20s,12000rpm离心12min。,11,步骤,4. 取上层液350 ul,加入另一新Eppendorf管中,加210 ul异丙醇,重新摇匀20s,室温放置15min,静置后的反应体系15000rpm离心12min,使沉淀紧贴Eppendorf管壁。 5. 弃异丙醇,加70乙醇1ml(不振动,可轻轻颠倒混匀),以15000rpm离心12min。,12,步骤,6. 弃乙醇,敞开Eppendorf管盖,烘干(37恒温箱)后,加1xTE溶液30ul,溶解DNA。(制成的DNA液置于-20冰箱保存备用) 7用DNARNA Calculator检测DNA的含量和纯度。纯DNA的此比值约为1.82.0。纯RNA的比值约为大于2.0。,13,步骤,8、限制性内切酶酶切: 下述各试剂加入Eppendorf管内: a、涡旋混匀,短暂离心。 b、置恒温水浴箱内,按EcoR I限制酶的活性温度要求,37酶解过夜 C、置于4或-20保存。,14,步骤,9、聚合酶链式反应: a、25 ul标准PCR反应体系各成分终浓度如下: b、标准PCR反应循环参数: 95:5 min预变性;94 30s 63 30s、 72 60s, 共30个循环; 72 7min。 c、置于4或-20保存。,15,
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