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肝糖原的提取、鉴定与定量,1,实验目的,1. 掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。 2. 了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。 3. 正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。 4. 熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合适的混匀方法）。 5. 正确掌握溶液转移的操作。 6. 正确操作使用分光光度计。,2,实验原理,（一）肝糖原的提取、鉴定 糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。,3,实验原理,（二）肝糖原的鉴定 糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。 CuSO4+2NaOH Na2 SO4+Cu(OH)2 2Cu(OH)2+ C6H12O6 2CuOH+氧化型葡萄糖+H2O 2CuOH Cu2O(红色)+H2O Cu(OH)2 CuO(黑色)+H2O,4,（三）肝糖原的定量 糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在(10100)mg范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法（直接比较法）即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其它成分，而保留肝糖原。,实验原理,5,实验材料,（一）仪器 1. 普通离心机，室温100恒温水浴箱（2），722型分光光度计，精度为10mg级电子天平（1） 2. 剪刀（1），镊子（1），研钵（1） 3. 试管架（1），10mL离心管（2），（10015）mm试管（6） 4. 刻度吸量管（2mL1，5 mL2），1000L微量可调取液器（1） 5. 100mL容量瓶（1） 6. 白瓷反应板（1）,6,实验材料,（二）试剂 1. 鸡肝。 2. 95乙醇。 3. 0.31mol/L(5)三氯醋酸溶液：称取未潮解的三氯醋酸（C2HCl3O2，163.39）5g，加蒸馏水溶解至100 mL。 4. 0.15mol/L NaCl溶液：称取8.8g NaCl加蒸馏水溶解至1000 mL。 5. 12mol/L HCl：浓HCl原液（36%38%）。 6. 12.5mol/L(50)NaOH：称取NaOH 50g，用蒸馏水溶解至100mL。 7. 碘试剂：碘l00mg和K1 200mg溶于50mL蒸馏水中。,7,实验材料,8. 班氏试剂：称取柠檬酸钠（C5H5Na3O75H2O，294.10）17.3g和无水碳酸钠（Na2C03，105.99）100g溶于蒸馏水700mL中，加热促溶。冷却，慢慢倾人17.3硫酸铜（CuSO45H2O，249.68） l00mL，边加边摇。再加蒸馏水至1000mL，混匀，如混浊可过滤取滤液。此试剂可长期保存。 9. 5.35mol/L(30)KOH溶液：称取KOH 30g，加蒸馏水溶解至100 mL。 11. 标准葡萄糖液(50mg/L)：称取已干燥恒重的无水葡萄糖25mg，加蒸馏水溶解至500 mL。 12. 17mol/L(90)H2SO4：量取蒸馏水30mL，加浓H2SO4500 mL。 13. 蒽酮显色剂：称取蒽酮0.20g，用17mol/L H2SO4溶解至100 mL。此试剂不稳定，以当日配制为宜，冰箱保存可用45天。,8,操作步骤,（一）肝糖原的提取,9,操作步骤,10,注意事项 1 肝糖原提取一步，向上清液中加人等量的95乙醇后，务必注意混匀。由于上清液为水溶液，比重大于95乙醇，溶液分成两层。加之上清液已4mL多，加上等量乙醇，总量接近9mL，混匀操作比较困难，最好用倾倒混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。 2 糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。葡萄糖残基在20个以下的会使碘呈现红色，2030个之间使碘呈现紫色，60个以上的会使碘呈现蓝色。淀粉中分枝链较长，故呈蓝色，而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在20个以下（通常812个葡萄糖残基），吸附碘后呈现红棕色。 3 糖原水解液中葡萄糖的鉴定一步，加班氏试剂不能过量，否则反应液呈黑色浑浊，观察不到应有的结果。,操作步骤,11,（二）肝糖原定量测定,操作步骤,12,操作步骤,13,
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