细胞重组与克隆技术.doc

第7章 细胞重组与克隆技术主要内容：7.1细胞重组 7.2克隆技术7.1 细 胞 重 组7.1.1 细胞重组的定义细胞重组（Cell Reconstruction）,又称细胞拆合是指从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器的一种实验技术。在探讨真核细胞的起源时。马吉利斯(MaRdls)曾于1972年提出了内共生学说：真核细胞起源于原核细胞，是几个原核细胞共生结合的结果。如蓝阴滴虫，细胞内含叶绿体，就是蓝藻在阴滴虫内共生的结果；绿草履虫体内的绿色物体，就是与之共生的一种小球藻。这种不同细胞的结合过程类似于细胞的自然装配。细胞的生长过程包含着细胞器的自我装配，但这是一种活体的自我装配，而细胞重组则是离体的装配过程。7.1.2 细胞重组的意义细胞重组技术是现代生物工程中的热点课题，细胞重组与细胞融合技术是细胞工程中的细胞或细胞器水平上主要构建手段，它与基因转移技术、干细胞技术等结合，可以人为地获得新物种或使细胞表达新的性状和新的产物。7.1.3 细胞重组技术发展概况7.1.4 几个重要概念胞质体(Cytoplast)：是指除去细胞核后由膜包裹的无核细胞。微细胞(Microcell)：是指只有一条或几条染色体和一薄层细胞质，外面包裹一层完整的细胞质膜的核质体。核体(Karyoplast)：是指与胞质分离得到的细胞核，带有少量胞质并围有质膜，称为核体。7.1.5 细胞重组的方式胞质体(Cytoplast)：与完整细胞重组形成胞质杂种(Cybrid)。微细胞(Microcell)：与完整细胞重组形成微细胞异核体(Heterokaryon)。胞质体与核体(Karyoplast)：重新组合形成重组细胞。7.1.6 细胞重组技术1、显微操纵术一般是在显微解剖镜下，把细胞放入消毒的培养液中，同时放入冷却系统中以减慢细胞发育，然后借助一台专门的装置显微操作仪，用细微玻璃针或用微细管、微电极、微热电偶等斜插入细胞中去，可以挑取细胞核，人工造就去核细胞；也可以进一步作移核实验与电生理实验。用这种仪器能够进行细胞各部分的解剖、细胞各部分物质的抽取和移植、各物质的注入、测量微电位的变化等等。意义:1、实现细胞的拆合2、为研究细胞内的基因表达与调控和改良动物品种提供了一种重要手段。2、细胞分离技术分离细胞主要是根据细胞本身的某些特殊性质来选择合适的分离技术来分离具有同一性状的细胞群、这些性质包括：细胞大小、密度、表面电荷、表面标志、细胞中一个或多个成分的荧光强弱、细胞对其他介质的吸附作用经常采用的细胞分离方法如下：（1）差速离心（differentialcentrifugation）在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器 在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。（速度升高，样品按大小先后沉淀）由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复23次效果会好一些。差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。对于精细的分离，则是密度梯度离心效果更好。（2）梯度沉降分离法主要是根据细胞大小不同分离细胞、细胞在单位重力作用下，通过密度介质、或在低离心力作用下通过梯度密度溶液沉降，由于细胞大小不同，沉降速度不同。细胞大，沉降快。常采用适当的分离介质形成一定的梯度密度溶液这此介质主要有：血清、蔗糖等：（3）等密度沉降分离法主要是根据细胞密度差异来分离细胞。细胞在连续密度梯度分离介质中、受强离心力的作用，最后到达与其密度相同的分离介质层面，并保持平衡。如果是非连续密度梯度介质中，细胞主要集中在介于其自身密度的两种密度介质交界面上，从而达到分离的目的。目前常采用的分离介质有蛋白等。密度分离剂应该具有无刺激，对细胞无吸附作用，产生的渗透压小等特点（4）流式细胞仪分离法这种方法是以免疫荧光法使荧光抗体与细胞膜表面抗原结合，然后用超声波处理使其分散成单个细胞，再将细胞悬浮液通过一个直径为50um的喷嘴变成极细小的微滴，每个微滴一般含有一个细胞，以l0m/s的速度喷出。经激光照射是细胞上所带荧光被激发而转换成脉冲通过测定脉冲数就可以换算出各种不同细胞表面抗原的情况。同时由于悬浮微滴中的细胞带有不同程度的负电荷，这样在施加电场后。移行偏斜的程度不同，而不带电荷的细胞仍以直线流过、借此可以收集得到不带电荷或带电荷多少不同的各种细胞。这种方法优点是分离速度快，分离得到的细胞仍能保持其功能；缺点是需要专门的设备。3、细胞破碎方法细胞器的分离需要将组织细胞破碎，常用的方法有：超声波破碎法；反复冻融法；化学裂解法；高速组织捣碎法。（1）超声波破碎法 原理是：超声波发生器产生高强度超声信号，经换能器传送至与其接触的细胞溶液中，由声波冲击和振动产生的剪切力使细胞破碎。 缺点是破碎过程中会产热，应该注意冷却。有些生物大分子不宜采用。（2）反复冻融法使细胞溶液或组织细胞浆在超低温冰箱或液氮罐内冻结后，在37复温融化，重复3-4次操作使细胞壁破碎。（3）化学裂解法 在细胞悬浮液中加入某些化学物质如十二烷基硫酸钠等使细胞膜裂解。在使用该方法的同时常要辅助以一些机械的方法才能使细胞在短时间内完全破碎；由于化学裂解剂会干扰分析，在细胞裂解后应注意清除化学裂解剂。（4）高速组织捣碎法主要借助高速组织捣碎机使细胞被高速旋转的叶片破碎。由于也会发热，可能导致分离物的降解，因此不能时间过长必要时可使用循环水冷却4、细胞器分离方法为了研究细胞内某种细胞器的生化组成、生理功能，或用于细胞重组，常需大量采集细胞的某些组分。常用的方法有：研磨、超声振荡和低渗等将组织制成匀浆，细胞中的一些亚组分就从细胞中释放出来。然后采用以上介绍的沉降分离法实现分级分离。【实验】细胞器分离、制备与观察【目的】（1）掌握分离制备动物细胞线粒体的方法。（2）对分离得到的线粒体进行活性鉴定。【原理】线粒体（mitochondria）是真核细胞特有的，司能量转换的重要细胞器。细胞中的能源物质脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过耦联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。将动植物组织制成匀浆，在适当的悬浮介质中用差速离心法可以分离细胞线粒体。在一定的离心场中(选用离心机的一定转速)，球心颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其他内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器沉降先后顺序是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。悬浮介质通常采用缓冲的蔗糖溶液，它较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性； pH7.2的条件下；亚细胞组分不容易重新聚集成团，有利于分离。 整个操作过程样品要保持在04，避免酶失活。细胞器标记酶的测定是评价细胞器内膜组分和分离纯度的主要依据，如线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶，该酶使詹纳斯绿B染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。*举例：鼠肝线粒体的分离1制备肝细胞匀浆： 实验前将鼠空腹12小时，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干水，称取肝组织2g，剪碎；用预冷的0.25 molL蔗糖溶液洗涤数次。然后按每克肝加4.5 mL预冷的0.25 molL蔗糖溶液的量，分数次添加蔗糖溶液，在04冰浴中用玻璃匀浆器将肝制成匀浆，用双层纱布过滤。2差速离心：将0.34 molL蔗糖溶液4.5mL放入离心管，然后沿管壁小心地加入4.5mL鼠肝匀浆覆盖于上层。用冷冻控温的高速离心按下图顺序进行差速离心。分离细胞核：活性鉴定： (1) 细胞核：取核沉淀1滴涂于载玻片，加入Carnoy固定液（甲醇：冰乙酸3:1）15 min，晾干。Giemsa染液染10 min，蒸馏水漂洗数秒，用滤纸吸干水、用显微镜(40)检查，细胞核呈紫红色，混杂的胞质为浅蓝色碎片。(2) 线粒体： 取线粒体沉淀滴在载玻片上，勿太密。滴加1詹钠斯绿溶液染液，10 min后用光学显微镜观察，线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。*5、胞质体、核体、微细胞的制备（细胞重组常用的几个原料，重点介绍）（1）胞质体方法：细胞松弛素B处理体外培养细胞能诱发其排核，结合高速离心得到了胞质体。影响制取胞质体的因素：容器，有玻璃片、塑料片、离心管、培养皿、培养瓶等，需在灭菌恒温培养室中进行。适宜的温度、细胞松弛素B的剂量、培养液浓度及其血清含量、离心速度、细胞密度等。特点：植物细胞的胞质体内的细胞器与完整细胞相同，具有内质网系、线粒体、溶酶体、高尔基体和中心粒及微粒、微管等骨架系统，各细胞器仍占有固有的位置。线粒体的运动十分活跃，线粒体膜上各酶系的分布及氧化磷酸化过程都照样存在。胞质体内线粒体内自主性的DNA复制尚能有限地进行着。蛋白质的合成在去核后的一段时间内持续进行。因此，去核细胞质体是深入研究细胞质作用的重要样品。（2）核体与胞质分离得到的细胞核，带有少量胞质并围有质膜，称为“核体”。核体能重新再生其胞质部分，继续生长、分裂。为了生产大量的核体，必须采用一系列的纯化技术，以防夹杂完整细胞和胞质体。可在去核处理后,从离心管底部收集样品,接种于培养皿内,温育1-2h，由于核体的贴壁率大大低于残留完整细胞的贴壁率，可从上清液中收集得到较纯净的核体。如此重复1-2次,可使核体的纯度高达99。 （3）微细胞秋水仙素及其衍生物和长春新碱等有丝分裂阻断剂能干扰微管的合成与装配，而使染色体停滞在有丝分裂中期。经体外培养，在单个染色体或染色体周缘就会重现核膜而形成含有一个微核、一薄层细胞质和一个完整质膜的微细胞。这种微细胞仅含有一个或数个染色体的DNA，也是细胞拆合工程的一种有用材料。（4）小结用上述方法从活细胞中拆散出来的胞质体、核体、微细胞为材料，通过显微操纵术，在光学显微镜下用显微操纵器把材料重新组合，加入病毒或化学物质如聚乙二醇等融合因子，经过一段时间的作用，可以把它们更新装配成新的活细胞。胞质体、核体和微细胞的制备6、细胞拆合的方法（1）物理拆合法：早期：使用的核、质分离方法是用紫外线或激光将核破坏，再用微玻璃针或微吸管将其他细胞核吸入后期：将细胞融合技术与显微外科手术结合，作微吸管将细胞核连同周围少量细胞质吸出，再吸入等量的灭活的病毒悬液，一并注入已去核的细胞中，让其发生融合（2）化学拆合法细胞松驰素效应：干扰细胞质的分裂；引起细胞表面形状的改变和排出细胞核；抑制细胞的运动；阻碍细胞的吞噬或胞饮；减低细胞的粘着程度；阻止神经细胞轴突的生长；影响葡萄糖和核苷酸的摄取；影响甲状腺素的分泌和生长激素的释放以及影响细胞质的流动；高浓度的细胞松驰素能使离体或活体的多种细胞发生明显的表面形态的改变。其中之一是在细胞表面产生所谓的“疱疹”胞质体和核体的制备将细胞培养在玻璃或塑料平板上，一般培养2天以上脱核。将经37预温的CB溶液（含CB10g/mL和小牛血清5%）5mL加入50mL离心管内，把生长有细胞的塑胶板面朝下，水平放入CB溶液中，在圆板上压上一个圆形的栓，以防止圆板移动位置。盖好离心管后，放入经37预温过的转头内进行离心。多数细胞株在11000-15000r/min离心15-30min，有80%的细胞脱核按上述去核过程，即可得到无核的胞质体和细胞核，但在被分离出的核中带有少量胞质并围有质膜，称为“核体”去核前作预离心，可去除贴壁不牢的完整细胞。去核以后一般用贴壁法纯化，即可利用核体贴壁附着性弱、完整细胞附着性强的特点进行纯化。重复两次，可把大部分完整细胞除掉微核体的制备秋水仙素及其衍生物和长春新碱等有丝分裂阻断剂能干扰微管的合成与装配，而使染色体停滞在有丝分裂中期。动物细胞受秋水仙碱作用，形成了大小不同的多个微核，用CB使微核从细胞分离出来。制备微核体的时候，用0.1g/mL秋水仙碱长时间（48h以上）处理细胞，细胞分裂就被控制在分裂中期，此时染色体动力终止，在单个染色体或染色体群之周缘重现核膜，形成了大小不同的多数微核，此时的细胞就叫微核化细胞。一般用14000r/min离心20min 即可脱核80-90%。7、细胞重组及细胞质杂交（1）动物细胞重组及细胞质杂交进行细胞重组时，在融合环圆板上放入核体(0.2mL)和仙台病毒(HVJ)0.1mL以及缓冲液0.5mL进行融合。进行细胞质杂交时，向圆板上加入完整细胞悬液0.5mL(一个圆板上约有细胞2-3105个)，放置15min以便细胞质体和完整细胞接触，然后吸除悬液，再加PEG 0.25mL作用30s。细胞融合处理后，加培养液洗融合环内的圆培养液反复4次吸引洗净后，加入10%-15%小牛血清培养液1-2h。最后用0.1%胰酶使融合细胞从板上脱落，移入新平皿内培养。融合后重组细胞株的分离。（2）植物的细胞重组使胞质体与核悬浮并沉淀在硝酸钙溶液中，除去上清液，先把它们悬浮，然后以适当比例使核与胞质体在试管中混合，离心，随后加入PEG处理使它们凝集，再慢慢加入硝酸钙溶液，促使核的摄入，其后洗涤、培养，把异核的原生质体培养成新的植株。（3）微生物的细胞核与原生质体融合核体的分离：降低原生质体渗透压使质膜破裂，同时保护核体和核膜的稳定使细胞核分离出来，经过蔗糖梯度离心纯化可得到提纯的核样品把核与营养缺陷互补的受体菌原生质体混合，在PEG的诱导作用下得到核与原生质体的融合产物7.2 克隆技术7.2.1 克隆的定义克隆(Clone)原指遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体的无性繁殖群体，现在也指一种实现无性繁殖的操作。克隆是指一种实现无性繁殖的操作，而不是一般意义上的无性繁殖。7.2.2 克隆的理论基础细胞全能性。 克隆在植物界已有上千年的历史。理论的上的突破在20世纪。 1902年德国植物学家哈伯兰德提出，植物的体细胞具有母体全部的遗体信息，具有发育成为完整个体的潜能。因而每个植物细胞都可像胚胎细胞那样，经离体培养再生成为完整植株。这就是所谓的细胞全能性。 理论上，任何一个细胞都含有其生物体系基因组的全部基因，都可以被克隆。实际上，动植物细胞克隆结果差别很大。克隆现象在植物界普遍存在。既可以是自然的，也可以是人工的。7.2.2 克隆的理论基础 与植物细胞不同，在动物发育过程中分化了的细胞不再产生完整的充分分化的个体，然而，动物胚胎的生长、分化和发育是否造成体细胞基因组的不可逆性修饰，即在发育过程中分化了的细胞是否具有与受精卵相同的核等价性或基因组连续性、一直是发育生物学要解决的问题 早在20世纪30年代，著名的胚胎学家斯佩尔曼就已经提出了分化了的细胞核移入卵子中能否指导胚胎发育这样的设想。用两栖类动物进行的一些克隆实验表明，早期胚胎细胞核经移植可产生成熟的动物个体。也就是说尚未分化的胚胎细胞具有全能性。基于这种认知、人们采用胚胎分割及胚胎细胞核移植技术成功克隆出了许多动物。 这种对动物细胞全能性的认识自1997年后得到改变，体细胞克隆动物“多利”羊的成功证明成熟的体细胞也具有全能性；后来，体细胞克隆小鼠、牛及山羊的成功，更充分证明高度分化的细胞核仍具有全能性。 因此，人们对细胞全能性有了全新的认识。7.2.3 克隆的技术方法目前，克隆技术最成功的应用体现在克隆动物的培育上。下面主要介绍以细胞核移植为核心的无性繁殖技术。（一）定义细胞核移植技术（Cell nuclear transplantation technology)是指利用显微操作技术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中，或者将两个细胞的细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能创造无性杂交生物新品种的一项技术。*细胞核移植技术 由于主要的遗传物质存在于细胞核中，因此，核移植的受体将具有与核移植供体完全相同的遗传基础，因此，细胞核移植技术在动物育种工作中具有十分重要的意义。 因为它像植物中的组织培养那样，可以利用一头优质的动物(例如高产的奶牛)复制出与它生得完全一样的成千上万的细胞核移植系动物。 细胞核移植技术是克隆技术的关键。 细胞核移植所得到的杂种称为核质杂种。 根据细胞核移植对象的不同可分为胚胎细胞核移植、体细胞核移植等。 开始时，进行细胞核移植主要是为了研究胚胎发育进程中细胞核和细胞质功能及两者之间的关系，探索有关遗传、发育和细胞分化等方面的理论问题。后来发现，这项技术可以实现不同细胞核和细胞质的组配，从而培育出新物种。（二）发展历史1、提出思想 第一个提出对动物进行细胞核移植实验的人是诺贝尔奖获得者德国胚胎学家汉斯施佩曼博士， 他构想了一个“奇异的实验”：把一个卵细胞的细胞核取出，然后把取自另一个发育到后期的胚胎的细胞核放入这个卵细胞中。 但由于技术等方面的原因使他没能找到将细胞核导入卵细胞的方法。2、建立技术及低等动物试验 1952（美）罗伯特.布里格斯和TJ金首先利用两栖类卵细胞建立了细胞核移植技术。3、高等动物试验 经过大量低等动物实验之后，研究人员开始进行哺乳动物的移核试验。最早用来作移核试验的哺乳动物是小鼠。 1977（美）杰克逊实验室用“亚无性繁殖”的方式，培育出7只单亲小鼠。因为此种小鼠的体细胞中只有母体一方的染色体，故称之为单亲小鼠。 随着技术发展，哺乳动物的细胞核移核实验开始进入一个令人嘱目的新阶段。 1981，瑞士日内瓦大学的卡尔伊尔门泽和美国杰克逊实验室的必得霍普首次对小鼠卵进行移核试验获得成功。他们将囊胚内细胞团细胞的核移入去核的受精卵中，经培养移核卵发育到囊胚期、再将此胚胎植入同步孕小鼠的子宫内，最后产下两雌一雄仔鼠，并发育成了可育的个体。 我国的细胞核移植技术工作开始于20世纪50年代，主要是在两栖类和鱼类上进行的。 1961，童第周等以金鱼和鳑被鱼为材料，进行鱼类不同亚科间的细胞核移植获得成功，用以研究杂交细胞核与纯种细胞核在发育功能上的差异以及细胞质对细胞核的影响。 1980.4，中国科学院武汉水生生物研究所用鲫鱼做移核试验，成功培育出两尾无性繁殖的幼鱼。 1989，童第周、牛满江将鲫鱼胚胎细胞核移入鲤鱼去核的未受精卵中，实现了不同种间的核质杂交，成功地无性繁殖了“鲤鲫核鱼”新品种，这个新品种的“鲤鲫核鱼”既具有鲫鱼的鲜美味道，又具有鲤鱼的生长快速。细胞核移植技术 2008，鲤鲫移核鱼是采用无性杂交的细胞工程技术，将荷包红鲤的囊胚细胞核移植到鲫鱼的去核卵中而发育形成的后代。 其鱼体呈红色，外形特征与鲤鱼相似，但也同时具有一些鲫鱼的特征，具有比较稳定的遗传性状。F1F4代（14子代），基本性状趋于一致。其生长速度明显快于鲫鱼，并且比荷包红鲤快35左右。 用鲤鲫移核鱼F2雄性与镜鲤杂交而获得的杂交一代被称为颖鲤。颖鲤具有明显的生长优势，其生长速度比 双亲快42左右。4、限制条件 细胞核移植必须有一个前提，就是要尽量保证核供体和受体细胞处于同样的细胞周期，高等细胞发展到一定阶段时都要进行有丝分裂，而各种细胞的有丝分裂周期是各不相同的。 在哺乳动物核移植实验中的核供体细胞和核受体细胞可能处在细胞周期的不同阶段上。现在可以通过采用“饥饿技术”来减慢细胞活动、迫使供体细胞处于某种休眠状态，以期获得与受体细胞同步的状态，便于两者的结合。5、 我国在细胞核移植技术选育鱼类新品种方面处于世界领先地位，以鱼类细胞核移植为例，详细介绍一下细胞核移植技术要点： (1)供体和受体的准备 供体通常为鱼类的囊胚细胞或成体细胞。 受体为成熟的卵细胞。该受体卵一般可通过人工催产的方法得到。卵子在接受供体核之前要先激活来获得发育能力。 对于鱼卵而言，当它被挤入水中即可被激活。对于两栖类动物的卵可采用针刺方法。最关键的是供体和受体在发育时间上要配合好，保证在受体成熟卵刚产出时,供体受精卵发育至囊胚期。 (2)去卵膜和卵核 可用小镊子在解剖显微镜下仔细剥去卵膜，或用适当的胰蛋白酶溶液软化卵膜，经过轻轻晃动，使卵子从中脱出。 鱼卵-极细的玻璃微针借助第二极体标志(卵核位于极体下方)挑出细胞核。 两栖类-紫外线照射受体卵达到去核目的。 (3)供体细胞制备 将发育至囊胚期的胚胎或组织器官进行机械切割，置于胰蛋白酶溶液中处理几分钟，直至分离出单个细胞。也可将囊胚细胞或得到的离体细胞短期培养后用作供体。 (4)移核 由于细胞核极小，而且脆弱，因此需要极其小心，防止损伤细胞核或伤害到细胞质。 实际上核移植时，核周围的少量细胞质也一起注射进了去核后的受体细胞中了。30-40min中内完成，温度：16-18（三）克隆动物一般制备技术 克隆可以通过不同来源的细胞核移植来实现，如胚胎细胞、干细胞、成纤维细胞、体细胞等。 其中以胚胎细胞克隆的应用比较普遍，以体细胞克隆的意义最大。1、移植细胞核的来源不同分为 胚胎细胞核移植法 胚胎干细胞核移植 胎儿成纤维细胞核移植 体细胞克隆技术（1）胚胎细胞核移植法 将未着床的早期胚胎分散成单个的细胞，在电流的作用下，使单个细胞与去除染色体的未受精的卵母细胞融合。发育成胚胎后，移入受体妊娠产仔。 原则上，一枚早期胚胎有多少个细胞，通过这种方法就可以克隆出多少个个体。还可将细胞反复克隆出更多的胚胎，产生更多克隆动物。 哺乳动物的胚胎细胞在分裂成8细胞以前，所有的单卵裂球均为全能细胞，即每个卵裂球均能表达此个体的全部基因。理论上这时的每个卵裂球经过核移植，都能发育成遗传性状完全相同的个体。 这些工作为进一步研究细胞核和细胞质的相互关系建立了很好的模型。（2）胚胎干细胞核移植 将胚胎或胎儿的原始生殖细胞经过抑制分代培养后，细胞数量增多，单细胞却不分化。因此，每个细胞仍然具有细胞全能性而发育成个体的能力，这样的细胞被称为胚胎干细胞系。 再利用细胞核移植技术，可以比胚胎核移植生产出更多的动物个体。 目前仅有小鼠分离克隆出其胚胎干细胞系并成功克隆出成体鼠。（3）胎儿成纤维细胞核移植 从妊娠早期胎儿分离出胎儿成纤维细胞，采用细胞核移植方法克隆出胚胎，经移植受体后，妊娠产仔，克隆出动物个体。（4）体细胞克隆技术将动物体细胞经过抑制培养，使其处于休眠状态，利用细胞核移植技术将其导入去核卵母细胞，发育成胚胎后移植至受体，妊娠产仔，克隆出成体动物。*克隆羊多莉培育过程： 克隆羊多利是由英国爱丁堡大学罗斯林学院 (Edinburghs Roslin Institute)的胚胎学家伊恩威尔马特 (Ian Wilmut)领导的科研小组从一只成年绵羊的乳腺细胞克隆出来的。1. 取处于后三分之一妊娠期的6岁母绵羊的乳腺细胞作核供体细胞，用“饥饿法”时期进入休眠状态而使全部基因具有活性。2. 从苏格兰黑面母绵羊摘取卵细胞，通过手术去除其细胞核（DNA的载体）作为受体细胞。3. 把白羊的乳腺细胞放入黑羊的已去除细胞核的卵细胞中，以一种弗兰肯斯坦（Frankensfein）式的技巧，用电脉冲使这些细胞的膜不仅结合在一起，而且，两个细胞即刻合而为一。4. 将新的卵细胞植入羊的的结扎的输卵管内，6天后发育成桑椹期胚胎或囊胚，再移入假孕母羊子宫内。5. 产下多莉即为6岁母羊的复制品，也为白色。*克隆动物成功与否的关键问题首先是核移植过程中要分离得到供体细胞和作为受体细胞的卵细胞 。 其次要取处在适当发育阶段及细胞周期的受体和供体细胞，受体细胞和供体细胞处于细胞周期中的同一时期 ，核移植成功的几率最大。 受体细胞在细胞周期中所处的时间对转核实验成功与否的影响要大于供体细胞所处的时间的影响，一般取G2期进行核移植的效果都较好。另外，细胞诱导分裂成熟的因子（MPF）的活性有关。*7.2.4 克隆技术的应用与意义 能使异种动物借腹妊娠、产仔，加快珍稀动物繁殖，抢救濒危动物(如大熊猫)； 建立重要疾病的基因模型，生产生物活性药物。 为了解细胞发育的潜能性、细胞核和细胞质之间相互关系、胚胎发生死亡及其调控研究提供了新视角，因此对揭示生命科学重大基础理论问题具有重要的科学价值。 动物克隆近几年取得的一些突破性进展，为动物发育过程中基因表达的调控及发育生物学、遗传学等相关学科的发展必将产生深远的影响。尽管目前这种方法尚不成熟，但它已显示出诱人的应用的前景。1、检验动物细胞的全能性 在多莉羊诞生之前，普遍认为低等生物和高等植物的细胞具有全能性，而高等动物的体细胞没有全能性。 目前克隆技术取得的结果，为再生、修复、治疗组织器官缺损等奠定了理论基础，也增加了采用高度分化的体细胞克隆各种动物的信心。2、加速动物繁殖、优良育种、保护珍贵动物 由于体细胞数量巨大和易于获得，因此动物克隆技术有助于加速动物育种的进程。 利用优良动物品种的体细胞作核供体克隆动物，可以避免自然条件下选种所受到的动物生育周期和生育效率的限制，从而大大缩短育种年限，提高育种效率。（大熊猫交配的季节在春季三至五月份，通常不超过24天。 ） 也可以结合基因工程技术将具有特殊功能的基因(如具有一些经济性状、抗虫、抗病等)导入体细胞，然后用克隆技术培育出人们希望的动物新品种。 2001.4，一种具有极高科学价值的商品利用克隆技术培育的金鱼由美国一家基因复制公司投放市场，这标志着克隆动物已经开始了商业化历程。3、克隆濒危物种 2002年4月27日,中国农业大学成功克隆了第一头优质中国黄牛, 这标志着中国在动物体细胞克隆领域取得了重要进展。这头名为“波娃”的体细胞克隆中国黄牛所使用的核供体细胞来源于一头不足六个月的冀南牛纯种小母牛的耳朵皮肤组织,而使用的卵母细胞取自于屠宰场宰杀后的母牛卵巢。“波娃”与其供体细胞的遗传物质完全相同,而与其代孕母亲荷斯坦奶牛在遗传上分属不同来源。该次克隆成功属国际首次,此次克隆中国优质黄牛的成功使目前挽救濒临灭绝的优良黄牛品种成为可能。4、克隆宠物 2004年8月6日美联社报道:美国加州“遗传储存与克隆”公司近日正式宣布,他们成功地培育出了世界上首对克隆宠物猫,今后,他们将在世界范围内推广宠物克隆业务,需要交纳5万美元的“克隆费”,你家的宠物就可以有个一模一样的伙伴了。5、医药领域 由于克隆动物的遗传背景相同，因此它们是模拟疾病、基因治疗、器官移植等研究的良好实验材料，具有良好的稳定性和重复性。 利用克隆技术，可以用患者本人细胞培育出新组织，用来治疗糖尿病、帕金森氏症、神经损伤等多种疾病。用这种方法培育出的组织不会产生免疫排斥反应，具有与患者正常组织完全相同的基因构成。 随着人类胚胎干细胞培养技术的完善，科学家已开始研究利用克隆技术培育人胚胎，希望大批量生产治疗疾病的干细胞 。 移植器官来源不足是各国存在的普遍问题，所以人们开始致力于异种器官移植和克隆器官移植的研究。利用克隆动物的胚胎干细胞作异源移植，以解决人类移植器官供求矛盾。 目前我国的年器官移植数量已经位居世界第二，其种类和成功率也都达到或接近国际先进水平。 但还存在着基础研究薄弱、研究体系分散和社会捐献活体器官意识不强、数量较低以及相应立法不完备等问题。 未来人类器官移植治疗将集中在人对人的同体器官移植、动物对人的异体器官移植和克隆人体器官移植等方面。 其中克隆人体器官更具有光明的前景，将解决一系列移植方面的关键问题，不过目前其实际运用还为时过早，因为虽然现在可以复制具有机械功能的脏器，但如何还原其生化作用还有待于探索。7.2.5 正确看待克隆技术1、技术尚不成熟 现阶段克隆动物等技术尚不成熟，还处于探索阶段。目前所得到的克隆动物具有极大的偶然性和随机性。迄今为止，克隆试验的成功率始终很低。（在培育多莉的过程中，科学家共克隆出277个绵羊胚胎，最终成功使母羊受孕并生产的只有多莉一个。此外，克隆动物夭折率高，不少克隆动物天生患有疾病或体形过大。）2、克隆动物的体细胞突变、寿命及其他遗传问题 基因突变与DNA复制次数紧密相关。分裂越多的体细胞发生突变的可能性就越大，这与通过克隆迅速获得大量动物个体的目的相矛盾，是克隆动物材料来源不可避免的问题。 同时，由于克隆是无性繁殖，克隆动物没有遗传物质的交流和互补，将会加剧一些遗传疾病的发生。 此外，出于体细胞分裂代数是有限的，因此克隆动物的寿命是否会受到体细胞分裂代数的影响，也尚不清楚。 2002年1月， “多莉”被诊断患有严重的关节炎，这是科学家对克隆生命的前景表示出担扰。 绵羊的平均寿命为为13年，多莉5岁半就患关节炎显然过早。 在多莉诞生后的3年多时间内，已获得了许多成活的体细胞克隆动物。但是，在大多数研究中，都出现了高频率的出生体重增加，以及胎儿或新生儿的死亡。因此、就目前的研究来看，动物克隆技术要实现产业化是非常困难的。3、是否是完全的“复制” 就遗传的角度而言。克隆动物的性状可能与其来源的亲本完全相同，但是至少以下一些因素会影响克隆动物的遗传性状： (1)细胞突变 (2)受体卵细胞的细胞膜和细胞质差异 (3)受体遗传上或生理上的差异 (4)后期生长的环境与驯化 大多数人认为，克隆是复制的同义词，复制品与原件是完全一样的。DNA的复制结果就是如此，所以复制用于DNA的合成是一个非常确切的术语。 克隆则是一个过程，克隆产生的个体还需进行胚胎发育和胎后发育，克隆个体与原件之间有一段年龄差异。由于发育过程既受基因主宰又受环境调控，而克隆与其原本尽管基因相同，所处环境却绝不会相同，所以，克隆与其原本不可能像复制品与原件那样完全一样的。 再者，虽然克隆个体是由核移植产生的，但由于重建细胞的细胞质并非来自原本，而我们知道细胞质中也有遗传物质，它们必然会对个体产生影响，所以不能把克隆个体看成是原本的复制品。 尽管从遗传结构上看克隆个体和原本是姐妹(兄弟)关系，但从年龄上看它们却是亲子关系。无性繁殖的生物仍然有”代”的概念，克隆个体也应有”代”的概念。 而且，克隆个体和原本是可以同时存在。因此，准确地说，克隆个体可以看成是原本的再生，但不是原本的复活。4、克隆动物可应用型的思考 有性生殖是生物在长期进化过程中的自我选择、适应环境的结果，是一种有利于种族繁衍和生存的生殖方式。 从这个角度来讲，用克隆动物繁殖生物可能给生物的生存和自然界带来意想不到的后果，同时，最关键的是，这种繁殖方式会造成基因的丢失，不利于遗传物质和生物多样性的保护。于是，有学者认为，克隆动物是违反生物进化规律的，是一种倒退。5、总之，克隆技术的低效率以及克隆动物后代出现的体重增加、体弱多病等事实，使得单独的克隆技术在近期内难以得到推广应用。在克隆技术还不成熟的今天，人类要克隆出健康的动物是相当困难的，克隆技术在实践中真正应用还有相当长的路要走。*克隆人问题克隆不能产生相同的人人类克隆自己是不道德的 许多国家都立法禁止克隆人“科学是一柄双刃剑”，如果有人利用克隆技术来克隆人，那会给人类带来无穷的灾难。