尿液分析技术和相关仪器ppt课件

第十三章 尿液分析技术和相关仪器, 尿液分析仪: 通过对尿液物理学检查和化学检查，可观察尿液物理性状和化学成分的变化。, 尿沉渣分析仪：对尿液中的有形成分，如红细胞、白细胞、上皮细胞、管型、巨噬细胞、肿瘤细胞、细菌、精子以及由尿液中沉析出来的各种结晶 (包括药物结晶) 等 进行分析统计。,尿液分析仪器,尿液分析仪,尿沉渣分析仪, 随着现代科学技术的发展，各种先进的检测技术，特别是电子技术及计算机的应用，不断提高尿液检查的自动化水平。同时由于计算机高速发展、血细胞分析仪和流式细胞仪的研制经验，尿沉渣全自动分析仪也相继问世，较好地解决了尿沉渣的自动化检查。, 对肾和尿路疾患的诊断、鉴别诊断以及疾病的严重程度和预后的判断，有重要意义.,(2) 临床意义,第一节 尿液分析仪,(1) 发展历史,20世纪40年代，出现了尿液干化学试剂带法，并成为利用尿液筛检健康人或患者的首选方法；,20世纪70年代，第一台尿液化学分析仪在问世，成为现代尿液分析的标志；,20世纪80年代，逐渐将色谱和免疫技术用于干化学试纸中，生产出具有检测敏感性和特异性极高的单克隆抗体的试剂带；,20世纪90年代以来，尿液分析仪自动化程度、性能得到迅猛发展。,1990年，尿液分析仪就已达到全部国产化。,一、尿液分析仪的分类,(一) 按工作方式分类, 湿式尿液分析仪,该系统仪器实际上是机械化了的试管法，属于分立式生化分析仪的一种。, 干式尿液分析仪,该系统仪器主要着眼于自动评定干试纸法的测定结果。该类仪器因结构简单、使用方便，目前临床普遍应用。,(二)按测试项目分类,18 项尿液分析仪,代表仪器：MA-4210型 (日本和国产)。 检测项目包括尿蛋白、尿葡萄糖、尿pH、尿酮体、尿胆红质、尿胆原、尿潜血和亚硝酸盐。,29 项尿液分析仪,代表仪器：RL-9 型(德国)。检测项目包括尿蛋白、尿葡萄糖、尿pH、尿酮体、尿胆红质、尿胆原、尿亚硝酸盐、尿红细胞(或潜血)和尿白细胞。,310项尿液分析仪,代表仪器： MIDITRON 型 (德国)、CLINITEK 200型 (美国)、 Uritest-100型(国产)。检测项目包括尿蛋白、 尿葡萄糖、 尿pH、 尿酮体、 尿胆红质、尿胆原、尿亚硝酸盐、尿红细胞(或潜血) ，尿白细胞和尿比重。,411项尿液分析仪,代表仪器： Clinitek Atlas型(美国)、URlSCAN-S300型(韩国)、Uritest-200型(国产)。检测项目包括尿蛋白、尿葡萄糖、尿pH、尿酮体、尿胆红质、尿胆原、尿亚硝酸盐、尿红细胞(或潜血)、尿白细胞、尿比重和颜色或维生素C。,(三)按自动化程度分类,1半自动尿液分析仪,代表仪器： MIDITRON型 (德国)， CLINITEK 200型(美国)，URISCAN-S300型(韩国)，Uritest-l00 型及Uritest-200型(国产)。检测项目主要包括尿8项、尿9项、尿10项或尿11项。,2全自动尿液分析仪,代表仪器： SUPERTRON型 ( 德国 ) ， Clinitek Atlas型(美国)。检测项目包括尿10项或尿11项。,二、尿液分析仪工作原理,(一)尿液分析仪的试剂带,1试剂带的结构, 单项试剂带：以滤纸为载体, 将各种试剂成分浸渍后干燥，作为试剂层，再在其表面覆盖一层纤维素膜作为反射层。一般把这样一条上面附有试剂块的塑料条叫做试剂带。尿液浸入试剂带后，与试剂发生反应，产生颜色变化。, 多联试剂带：将多种项目试剂块集成在一个试剂带上。使用多联试剂带，浸入一次尿液可同时测定多个项目。,第一层尼龙膜起保护作用，防止大分子物质对反应的污染； 第二层绒制层，它包括碘酸盐层和试剂层，碘酸盐层可破坏维生素C 等干扰物质，试剂层含有试剂成分，主要与尿液中所测定物 质发生化学反应，产生颜色变化； 第三层是固定有试剂的吸水层，可使尿液均匀快速地浸入，并能抑 制尿液流到相邻反应区； 最后一层选取尿液不浸润的塑料片作为支持体。,2试剂带的反应原理,(1) pH测定：采用pH指示剂原理，常用甲基红和溴麝香草酚蓝组成的复合型指示剂，呈色范围从 pH4.5pH9 颜色由橘黄色、绿色变为蓝色，由此反映尿液pH。,(2) 尿蛋白质测定：利用pH指示剂蛋白质误差的原理。由于各种指示剂都具有一定的pH变色范围，当溶液中存在蛋白质时，蛋白质离子可与带相反电荷的指示剂离子结合，引起指示剂的进一步电离，从而产生颜色变化，其颜色深浅与蛋白质的含量有关。,(3) 尿葡萄糖测定, 基于葡萄糖氧化酶法原理，能特异地检出尿中的葡萄糖。利用葡萄糖在有氧和水的条件下，被葡萄糖氧化酶氧化成葡萄糖酸和过氧化氢。过氧化氢在过氧化酶催化作用下释放出新生态氧，使色原氧化而显色，其颜色深浅与尿中葡萄糖含量有关。, 基于铜还原法的原理，能检测葡萄糖和其他还原性物质。铜还原法是基于尿中葡萄糖和其他还原性物质能还原硫酸铜成氧化铜的原理而显色。目前采用铜还原法制成的试带为Clinitest 试带，检测敏感性为2g/L。,(4) 尿酮体测定：采用亚硝基铁氰化钠反应测量酮体。在碱性条件下，尿中酮体和亚硝基铁氰化钠反应而显色，其颜色深浅与酮体含量有关。,(5) 尿隐血测定：利用游离血红蛋白、溶解红细胞或肌红蛋白中的血红素具有过氧化物酶样作用，能催化过氧化氢释放出新生态氧，使色原氧化而显色，其颜色深浅与血红蛋白含量有关。,(6) 尿胆红素测定：采用重氮反应法原理。在酸性条件下，尿中直接胆红素能与重氮盐起偶联反应形成重氮色素，颜色深浅与尿中胆红素量的多少有关。,(7) 尿胆原测定：采用Ehrlich醛反应原理或重氮反 应原理。, Ehrlich醛法试带利用尿胆原在酸性条件下与对二甲氨基苯甲醛反应形成红褐色的复合物，颜色深浅与尿胆原含量有关。, 重氮法试带利用尿胆原在强酸性条件下，与4-甲氧基苯重氮盐四氟化硼酸盐反应生成重氮色素，其颜色深浅与尿胆原含量有关。,(8) 尿亚硝酸盐测定：尿亚硝酸盐试验的化学基础是利用某些细菌能将尿中硝酸盐还原成亚硝酸盐的特性。在酸性条件下，使亚硝酸盐与芳香胺结合形成重氮化合物，再与苯喹啉结合产生重氮色素，颜色变化与细菌数量不成比例，但阳性结果表明尿中细菌数量在105/ml 以上。,(9) 尿白细胞测定：利用中性粒细胞的酯酶能水解吲哚酚生成吲哚酚和有机酸，吲哚酚可进一步氧化成靛蓝的原理；或吲哚酚和重氮盐反应成重氮色素而显色，颜色深浅与粒细胞量的多少有关。,(10) 尿比密测定： 基于某种预处理的多聚电解质在一定离子浓度溶液中pKa变化来测量比密。尿液中电解质离子可和聚甲乙烯顺丁烯二酸共聚体中的氢离子发生置换，换出的氢离子使溴麝香草酚蓝指示剂的颜色发生变化，颜色由蓝绿色、绿色变成黄绿色。,(11) 尿维生素C测定：采用磷钼酸缓冲液或甲基绿与尿中维生素C进行反应，形成钼蓝，颜色由蓝色变成紫色，颜色深浅与尿中维生素C含量有关。,3试剂带的应用,不同型号的尿液分析仪一般使用自己配套的专用试剂带。试剂块要比测试项目多一个空白块，有些仪器还多一个位置参考块(固定块) 。各试剂块与尿液中被测定成分反应而呈现不同颜色。,空白块是为了消除尿液本身的颜色及试剂块分布状态不均等产生出测试误差，提高测量准确度而设置的。,位置参考块(固定块)是为了消除在测试过程中每次测定试剂块的位置不同产生测试误差设置的。,(二) 尿液分析仪检测原理,颜色的深浅与光的反射率成比例关系，而颜色的深浅又与尿液中各种成分的浓度成比例关系。所以只要测 得光的反射率即可以求得尿液中各种成分的浓度。,测量方法：双波长法。 测定波长，被测试剂块的敏感特征波长； 参比波长，被测试剂块的不敏感波长；,各测试块所用的测定波长： 亚硝酸盐、酮体、胆红素、尿胆素原：550nm pH、葡萄糖、蛋白质、维生素C、潜血：620nm 各试剂块所用的参考波长：720nm,采用空白块和双波长测定法，消除尿液本身颜色引起误差，提高测量精度。,总反射率,三、尿液分析仪的的结构与功能,尿液分析仪组成：机械系统、光学系统、电路系统,(一)机械系统,将待检试剂带传送到位，检测后排送到废物盒。,(二)光学系统,包括光源、单色处理、光电转换,(1) MA-4210型和国产Uritest-100/200型尿液分析仪，采用光源灯(卤灯)发出白光通过球面积分仪的通光筒照射到试剂带上，试剂带把光反射到球面积分仪中透过滤色片得到单色光。,(2) MIDITRON 型尿液分析仪，采用了可发射特定波 长的发光二极管(LED)作为检测光源，,(3) CLINTEK 200 型尿液分析仪，以高亮度的卤钨灯 为光源，经光导纤维传导到两个检测头。,(4) URISCAN-S300型尿液分析仪，采用了目前比较尖端的光学元件CCD技术进行光电转换。它是把反射光分解为红绿蓝(RGB：610nm、540nm、460nm)三原色，又将三原色中的每一种颜色分为2592色素，这样整个反射光分为7776色素，可精确分辨颜色由浅到深的各种微小变化。,CCD器件具有良好的光电转换特性，光电转换因子可达99.7%，其光谱响应范围0.41.1m。通常采用高压氙灯作光源，发光光谱接近日光，放电通路窄，可形成线状光源或点光源, 发光效率高。,(三)电路系统,光电二极管 前置放大 电子开关 V/F 计数器 CPU 打印输出,四、尿液分析仪的安装、调校,五、尿液分析仪的使用注意事项及维护与保养,第二节 尿沉渣分析仪,尿沉渣分析仪器的发展,1显微镜 ： 普通光学显微镜，偏光显微镜、位相显微镜、荧光显微镜。,2尿沉渣自动分析仪,1988年，Y-1高速摄影机式尿沉渣自动分析仪(影像/美),1990年，UA-1000型尿沉渣自动分析仪(影像/日,美),UA-2000型尿沉渣自动分析仪,1995年，UF-100型全自动尿沉渣分析仪(流式/日),SEDTRON(影像/德国),2000年，R/S2003 尿沉渣定量分析工作站(美),一、流式细胞术尿沉渣分析仪,(一)工作原理,与流式细胞仪相似,测量内容：,前向荧光强度FI,前向散射光强度FSC,细胞体积电阻抗 imp,尿液导电率,测量结果：,直方图，散射图,(二)仪器结构,光学系统, 液压系统, 电阻抗/电导率检测系统 , 电子系统,1光学系统,光学系统由氩激光、激光反射系统、流动池、前向光采集器和前向光检测器组成。,(1) 信号来自前向散射光 和 前向荧光,(2) 染料（UF-100型全自动尿沉渣分析仪为双染料）,菲啶染料：主要染细胞核酸成分(DNA)，488nm激发，产生610nm橙黄色光波，用于区别有核的细胞和无核的细胞(如白细胞与红细胞、病理管型与透明管型的区别)。,羧化氰染料：穿透能力较强，与细胞质膜(细胞膜、核膜和线粒体)的脂层成分结合，460nm激发，产生505nm的绿色光波，主要用于区别细胞的大小(如上皮细胞与白细胞的区别)。,特性：反应快速；背景荧光低；从细胞发出的荧光强度与染料和细胞的结合程度成比例。,2液压(鞘液流动)系统,鞘液形成一股液涡流，使尿液细胞排成单个的纵列。这两种液体不相混合，这就保证尿液细胞永远在鞘液中心通过。鞘液流动机制提高了细胞计数的准确性和重复性，防止错误的脉冲，减少流动池被尿液标本污染的可能。,3电阻抗/电导率检测系统,电阻抗检测系统包括测定细胞体积的电阻抗系统和测定尿液导电率的传导系统。,(1) 细胞体积电阻抗测定方法：当尿液细胞通过流动池小孔时，在电极之间产生的阻抗使电压发生变化。尿液细胞通过小孔时，细胞和稀释液之间存在着较大的电导率或电阻抗的差异，阻抗的增加引起电压之间的变化，它与阻抗改变成正比例。,(2) 尿液导电率测定方法：采用电极法。样品进入流动池前，在样品两侧各个传导性感受器接收尿液样品中的导电率电信号，并将电信号放大直接送到微处理器。,4电子系统,前向散射光很强，并不需要极敏感光检测器，光电二极管能够将光信号转变电信号。,前向荧光很弱，因此需要使用极敏感的光电倍增管。,所有这些电信号通过波形处理器整理，再输给微处理器汇总，得出每种细胞的直方图和散射图，通过计算得出每微升各种细胞数量和细胞形态。,(三)尿沉渣细胞的识别分析,通过对前向散射光波形(散射光强度和散射光脉冲宽度)、前向荧光波形(荧光波长和荧光脉冲宽度)和电阻抗值的大小综合分析，得出细胞的形态、细胞横截面积、染色片段的长度、细胞容积等信息并绘出直方图和散射图。仪器通过分析每个细胞信号波形特性来对其进行分类。,前向散射光信号：,前向荧光信号：,(四)检测项目和相应的参数,1红细胞(RBC),特征：在尿液中直径大约是8.0m，没有细胞核和线粒体，荧光强度(FI)很弱。红细胞在尿液标本中大小不均，且部分溶解成红细胞碎片，或者在肾脏疾患时排出的红细胞也大小不等，故红细胞前向散射光强度(Fsc)差异较大。一般来看，FI极低和Fsc大小不等的都可认为红细胞。由此给出尿红细胞数量。,尿红细胞其他参数： 均一性红细胞(Isomorphic RBC)百分比， 非均一性红细胞(Dysmorphic RBC)百分比， 非溶血性红细胞的数量(Non-Lysed RBC#)和百分比(Non-Lysed RBC%)； 平均红细胞前向荧光强度(RBC-MFI)， 平均红细胞前向散射光强度(RBC-MFsc)， 红细胞荧光强度分布宽度(RBC-FI-DWSD)。,2白细胞,特征：白细胞在尿液的分布直径大约为10m，比红细胞稍大，前向散射光强度则也比红细胞稍大一些，但白细胞含有细胞核而红细胞无细胞核，因此它有高强度的前向荧光，能将白细胞与红细胞区别开来，白细胞出现在散射图的正中央。白细胞也像红细胞那样有很多形状，当白细胞存活时，白细胞会呈现前向散射光强和前向荧光弱；当白细胞受损害或死亡时，会呈现前向散射光弱和前向荧光强。,尿白细胞其他参数： 平均白细胞前向荧光强度(WBC-MFL)， 平均白细胞前向散射光强度(WBC-MFsc)。,3上皮细胞(EC),上皮细胞由泌尿道上皮脱落而来，种类较多，大小不等。因为上皮细胞体积大，散射光强，且都含有细胞核、线粒体等，荧光强度也比较强。,仪器还标出小圆上皮细胞(SRC)，小圆上皮细胞，小圆上皮细胞是指细胞大小与白细胞相似或略大，形态较圆的上皮细胞，包括肾小管上皮细胞、中层和底层移行上皮细胞。这些细胞散射光、荧光及电阻的信号变化较大，仪器不能完全区分出哪一类细胞。因此当仪器标出这类细胞的细胞数到达一定浓度时，还须通过离心染色镜检才能得出准确结果。,4管型,透明管型由于管型体积大和无内含物，有极高的前向散射光脉冲宽度和微弱的荧光脉冲宽度；而病理性管型 (包括细胞管型) ，由于它们的体积与透明管型相等，但有内含物 (如线粒体、细胞核等) ，所以有极高的前向散射光脉冲宽度和荧光脉冲宽度。,借助于荧光脉冲宽度，即可区分出透明管型和病理管型，但不能完全判定是哪一类管型，只有通过离心镜检才能确认，对疾病诊断才会有真正的帮助。,管型(Casts)一般由Tamm-Horsfall蛋白、血浆蛋白、肾小管分泌物、变性的肾小管上皮细胞、白细胞、红细胞及其崩解产物所组成。管型通常在远端肾小管塑形而成，由于常成长条圆柱体（Cylinder）,故在尿中又称圆柱体尿。它的出现往往提示有肾实质性损害。,5细菌,细菌由于体积小并含有DNA和RNA，所以前向散射光强度要比红、白细胞弱，但荧光强度要比红细胞强，又比白细胞弱，因此细菌分布在散射图红细胞和白细胞之间的下方区域。,细菌检查的临床意义：用于对泌尿细菌感染的诊断。,6其他生化检测,能标记出酵母细胞(YLC)、精子细胞(SPERM)、结晶(XTAL)，并能够给出定量值。,7导电率的测定,导电率与渗量有密切关系。导电率代表溶液中溶质的质点电荷，与质点的种类、大小无关；而渗量代表溶液中溶质质点(渗透活力粒子)数量，与质点的种类、大小及所带电荷无关，所以导电率与渗量又有差异。,(五)仪器的安装、使用、注意事项及保养,二、影像式尿沉渣分析仪,(一) SEDTRON尿沉渣分析仪,SEDTRON是一台自动化尿沉渣分析仪，主要由检测系统和电脑控制一体化的操作系统组成。,1. SEDTRON尿沉渣分析仪的原理,两个快速移动的CCD摄像镜头对样本计数池扫描，其镜头的放大倍数一个为100倍(低倍视野)，另一个为400倍(高倍视野)，每确定一个焦距，镜头所得影像数据化，并取6个平衡数据。,SEDTRON的细胞计数板(样品板)可放置10个经预处理已离心染色的样品，将计数板插入槽架，自动传入扫描平台，仪器便自动扫描。,2. 检测分类的项目,高倍视野：红细胞(RBC)，白细胞(WBC)，小圆上皮细胞(SRC)，酵母菌(YEA)，细菌(BAT)，结晶(CRY),3. 操作控制系统,操作控制系统为电脑一体，面板操作键盘简易，具有人机对话的菜单键。所有操作对话和扫描图像可显示在35cm的荧光屏上。,低倍视野：管型(PCAS)， 鳞状上皮细胞(EPl)，小圆上皮细胞(SRC)，结晶(CRY)。,4. 检测方法,取随机新鲜尿液样本10ml于离心管，使用1500r/min，离心5min，弃去上清液，留取沉渣0.5ml。加入50l染色液染色5min摇匀，用微量移液管吸取尿沉渣注入SEDTRON样品板计数池(注意液体不要外溢)，便可用于检测。,(二) UD自动染色尿沉渣分析仪,组成: 尿沉渣仪主机, 流动计数器, 沉降器, 溶液瓶(分别装清洗液、强制清洗液、染色液、废液)等。,UD自动染色尿沉渣分析仪可与摄像显微镜、显微摄像装置以及计算机、显示器、打印机连接。在计算机控制下快速、自动完成标本和染色液的定量提取、混合染色一系列自动程序，将混合、染色好后的分析标本输送至特制的光学流动计数池中，通过显微镜摄像装置，操作者即可在显示器屏幕上获得清晰的彩色尿沉渣图像，通过人工对尿沉渣中有形成分进行定性分析、计数，再由计算机以标准格式输出尿常规分析的真彩色图文报告。,1UD自动染色尿沉渣分析仪工作原理,2UD的主要功能及特点,(1) 仪器定量准确 (2) 自动化程度高 (3) 符合标准化要求 (4) 安全洁净 (5) 智能控制 (6) 功能齐备,三、尿沉渣分析工作站,第三节 尿液分析仪的质量控制,第十三章 尿液分析仪器 作 业： 1总结尿液分析仪的检测原理, 尤其是加入空白块和采用双波长测定法消除尿液本身颜色引起误差的原理。 2简述流式细胞术尿沉渣分析仪的结构，尿沉渣细胞的识别分析原理。,Ar+激光器产生一系列靠得很近的谱线，所以利用一对多层介质膜反射镜，Ar+激光器可以获得若干条谱线的同时振荡，产生振荡的谱线条数和各条谱线的相对强度，随激光器工作条件不同而有所差异。下表列出了某单模总输出功率为8W的Ar+激光器各振荡谱线的波长和输出功率。其中以488.0nm和514.5nm两条谱线的激光输出最强。改变介质膜的反射特性，可使激光器的振荡谱线和相对强度改变。在腔内或腔外利用棱镜分光可获得所需要的单一谱线振荡。,Ar+激光谱线的波长和长度,