DBS45 023-2015 食品安全地方标准 水牛乳及其制品中掺入牛属乳的定性检测 PCR法.doc

ICS点击此处添加ICS号点击此处添加中国标准文献分类号DBS45广西壮族自治区地方标准DBS 45/02320154食品安全地方标准 水牛乳及其制品中掺入牛属乳的定性检测PCR法（报批稿）（审定稿报批稿）2014 2015 - XX 03- XX05发布2014 2015 - XX 04 - XX05实施广西壮族自治区卫生计生委广西壮族自治区卫生和计划生育委员会 发布发布 DBS 45/02320154前言本标准按照GB/T 1.12009的格式编写。本标准由广西壮族自治区卫生和计划生育委员会提出。本标准起草单位：广西壮族自治区水牛研究所、广西壮族自治区分析测试研究中心。本标准起草人：曾庆坤、林波、黎颖、李玲、卢安根、杜寒春、巫坚、黎德全、黄丽、刘永强。10水牛乳及其制品中掺入牛属乳的定性检测 PCR法1 范围本标准适用于水牛乳及其制品中掺入牛属乳的 PCR 定性检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 19495.2-2004 转基因产品检测实验室技术要求GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义3.1水牛乳水牛属动物（Bubalus bubalis ）乳腺分泌产生的乳白色液体物质。3.2牛属乳牛属动物（Bos taurus），包括荷斯坦和娟姗牛乳腺分泌产生的乳白色液体物质及其制品。3.3水牛乳制品以生水牛乳为原料，经过相应工艺加工制成的液态乳、发酵乳和干酪等各种产品的总称。3.4PCR(聚合酶链反应)聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是一种在体外快速扩增特定基因或DNA片段的方法。由“热变性复性延伸”三步反应组成一个PCR循环，经过多次循环反应，使目标DNA得以大量扩增。3.5特异性引物针对特定模板 DNA 片段设计的两段与模板两端分别互补的一对寡核苷酸序列，在PCR反应中与模板 DNA 两端分别特异性结合。3.6 阳性掺入对照从生水牛乳与生牛属乳比例为1：1的混合乳中按照6.1.1的操作提取得到的总DNA，按照6.3的PCR程序扩增后，经电泳检测会在220bp和346bp位置各出现一条电泳条带。3.7 阴性掺入对照从生水牛乳中按照6.1.1的操作提取得到的总DNA，按照6.3的PCR程序扩增后，电泳检测仅在220bp位置出现一条电泳条带。3.8阴性质控对照在PCR扩增时，用双蒸水代替模板，其它操作相同。4 方法原理采用DNA提取试剂或试剂盒，提取样品中的DNA，以提取的DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，对比DNA标准分子量条带，检验PCR产物是否有大小为220bp的水牛特异性条带或346bp的牛属特异性条带，特异性条带的核苷酸序列信息见附录A，从而对水牛乳或水牛乳制品中是否掺入牛属乳进行检验和判断。5 试验材料5.1 特异性引物根据12S rRNA基因的核苷酸序列设计引物，其中一条为水牛与牛属牛12S rRNA的通用引物，另两条分别为扩增水牛12S rRNA基因与牛属牛12S rRNA基因的特异性引物，扩增水牛12S rRNA基因片段大小为220bp ，扩增牛属牛12S rRNA基因片段大小为346bp。引物序列见附录 B.1，使用前先用灭菌双蒸水稀释，引物稀释后分装成小剂量置于 -20 保存备用。5.2 试剂除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682-1992的灭菌双蒸水或超纯水。5.2.1 DNA抽提试剂酚-氯仿-异戊醇法抽提DNA试剂如下:消化缓冲液（10 mmol/L Tris-Cl，pH7.6；2 mmol/L EDTA，pH 8.0；0.5% SDS；75 mmol/L NaCl）；20mg/mL 蛋白酶K；Tris饱和苯酚；氯仿；3 mol/L 乙酸钠；无水乙醇；异丙醇；75%乙醇；TE缓冲液(10 mmol/L Tris-Cl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)。或用等效的食品专用DNA抽提试剂盒。5.2.2 PCR 试剂、电泳试剂、其它试剂Taq DNA 聚合酶；dNTPs混合物：包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP；MgCl2；或 PCR Mix试剂盒。核酸染料GelRed；6DNA电泳上样缓冲液；1倍Tris-硼酸电泳缓冲液。灭菌双蒸水；1 mol/L 灭菌 PBS，pH7.4。5.2.3 试剂配制方法试剂配制方法见附录 C。5.3 仪器设备及耗材5.3.1 仪器设备PCR 仪；电泳仪；电泳槽；核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计；凝胶成像系统；低温离心机；小型高速离心机；水浴锅；旋涡振荡器；掌上离心机；微量加样器：100L1 000L、20L200L、10L100L、0.5L10L和0.1L2.5L等多种规格。5.3.2 一次性耗材一次性PE手套；离心管：1.5mL；PCR反应管：0.2mL；吸头：1 000L、200L、10L等多种规格。6 操作程序6.1 待检样品的DNA抽提6.1.1 生水牛乳及液态水牛乳制品样品的DNA提取取50mL乳样于50mL离心管中，2500r/min离心20min，用小勺撇去离心管上层的乳脂，再用吸管将上清液吸出，保留最底部的沉淀，用无菌棉球或棉签擦除离心管壁上残存乳脂；然后向离心管中加入20mL pH7.4的PBS，轻轻敲打离心管使沉淀悬浮，2500 r/min离心20 min，用吸管将上清液吸出，保留最底部的沉淀，再用无菌棉球擦除离心管壁上残存乳脂；如果乳脂残存过多，再次重复向离心管中加入20mL pH7.4 PBS、离心、除脂的操作步骤；最后将上清液吸出，保留最底部的沉淀；按照食品专用DNA抽提试剂盒中步骤抽提DNA。DNA提取除采用试剂盒外，也可采用酚-氯仿-异戊醇法(用酚-氯仿-异戊醇法提取DNA的步骤见附录D)提取。DNA提取后置于-20保存。6.1.2 发酵水牛乳样品的DNA提取取一定量(约10 mL或10g)样品于50mL离心管中，然后向离心管中加入20mL pH7.4的PBS，轻轻敲打离心管使沉淀悬浮，2500r/min离心20min，用小勺撇去离心管上层的乳脂，再用吸管将上清液吸出，保留最底部的沉淀，再用无菌棉球擦除离心管壁上残存乳脂；如果乳脂残存过多，再次重复向离心管中加入20mL pH7.4的PBS、离心、除脂的操作步骤；最后将上清液吸出，保留最底部的沉淀；按照食品专用 DNA 抽提试剂盒中步骤抽提DNA。DNA提取除采用试剂盒外，也可采用酚-氯仿-异戊醇法(用酚-氯仿-异戊醇法提取DNA的步骤见附录D)提取。DNA提取后置于-20保存。6.1.3 水牛乳干酪样品的DNA提取取2g干酪样品，充分研碎后置于50 mL离心管中；然后向离心管中加入20mL pH7.4的PBS，捣碎并剧烈震荡使沉淀悬浮，2500r/min离心20min，用小勺撇去离心管上层的乳脂，再用吸管将上清液吸出，保留最底部的沉淀，再用无菌棉球擦除离心管壁上残存乳脂；如果乳脂残存过多，再次重复向离心管中加入20mL pH7.4的PBS、离心、除脂的操作步骤；按照食品专用DNA抽提试剂盒中步骤抽提DNA。DNA提取除采用试剂盒外，也可采用酚-氯仿-异戊醇法(用酚-氯仿-异戊醇法提取DNA的步骤见附录D)提取。DNA 提取后置于-20保存。注： 以酚-氯仿-异戊醇法或食品专用DNA抽提试剂盒提取酸乳和干酪DNA的过程中，如果使用蛋白酶K消化后，所得溶液比较浑浊的话，再次添加相同量的蛋白酶K，并延长一倍的孵化时间，以确保蛋白消化完全。6.2 DNA浓度和纯度的测定取5L DNA溶液加双蒸水稀释至1mL，用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值 A260和 A280。DNA的浓度按照式（1）计算：c=AN50/1000 （1）式中：cDNA 浓度，单位为微克每微升（g/L）；A260 nm处的吸光值；N核酸稀释倍数。当 A260/A280比值在1.7-1.9之间时，适宜于PCR扩增。6.3 PCR扩增在冰浴条件下，按25L的PCR反应体系用量在PCR反应管中分别加入各PCR试剂，每个样本做三个平行，同时PCR扩增阳性掺入对照、阴性掺入对照和阴性质控对照。25 L的 PCR 反应体系试剂用量如下：PCR Buffer（5）5L、MgCl2（25mmol/L）2.0L、Taq DNA聚合酶（1U/L）0.5L、引物B1（10 M/L）和B2（10 M/L）各0.5L、引物C1（10 M/L）1L、dNTPs 混合物（10 mM/L）0.5L、模板 DNA（0.1 g1.0 g）2L、灭菌双蒸水8L。除按上述配制外，也可采用 PCR Mix试剂盒。加完试剂后瞬时离心混匀，将PCR反应管均置于PCR仪内，按下面反应程序进行PCR反应： 94，3min；然后进入94变性30s；58退火30s；72延伸45s的循环，共进行40个循环；72，10 min；4结束扩增。PCR 产物直接进行琼脂糖凝胶电泳分析或置4保存备用。6.4 电泳6.4.1 1.5%琼脂糖凝胶制备制备方法见附录 E。6.4.2 加样分别将样品、阳性掺入对照、阴性掺入对照和阴性质控对照的5L PCR 产物与 1L 6DNA电泳上样缓冲液混合均匀，加至琼脂糖凝胶样品孔中（如用含Loading dye 的PCR Mix试剂盒进行PCR反应可直接上样），同时设置标准 DNA 分子量对照。6.4.3 电泳条件调整电泳仪至70V电泳约45min，直至溴酚蓝指示剂到达离琼脂糖凝胶末端 2cm3cm 时停止。7 结果判定将电泳后的琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统内观察，与标准DNA分子量比较，只有阳性掺入对照、阴性掺入对照和阴性质控对照结果正确时才能进行受检样品的结果判定，然后拍照保存。如果样品仅在220 bp位置出现水牛特异性条带，判定为纯水牛乳或纯水牛乳制品。如果样品仅在346bp 位置出现牛属特异性条带或没有条带，则判为非水牛乳或非水牛乳制品。如果样品在 220bp位置出现水牛属特异性条带，且同时在346bp位置出现牛属特异性条带，则判为掺假水牛乳或掺假水牛乳制品。注：检测结果凝胶电泳图见附录B.2。附录A（规范性附录）水牛属和牛属特异性片段序列A.1 水牛属特异性片段序列CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAAACCCCGATAGACCTCACCAATTCTTGCTAATGCAGTCTATATACCGCCATCTTCAGCGAACCCTAAAAAGGTACAAAAGTAAGCGCAATCACAACGCATAAAAACGTTAGGTCAAGGTGTAACCTATGAAATGGGAAGAAATGGGCTACATTTTCTACACCAAGAACACCCAACACGAAAGTTATTATGAAAA.2 牛属特异性片段序列CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAAACCCCGATAAACCTCACCAATTCTTGCTAATACAGTCTATATACCGCCATCTTCAGCAAACCCTAAAAAGGAAAAAAAGTAAGCGTAATTATGATACATAAAAACGTTAGGTCAAGGTGTAACCTATGAAATGGGAAGAAATGGGCTACATTCTCTACACCAAGAGAATCAAGCACGAAAGTTATTATGAAACCAATAACCAAAGGAGGATTTAGCAGTAAACTAAGAATAGAGTGCTTAGTTGAATTAGGCCATGAAGCACGCACACACCGCCCGTCACCCTCCTCAAATAGGATTCAGTGCATCTAACCCTATTTA附录B （规范性附录）特异性引物序列及检测结果电泳图示B.1 特异性引物序列合成的特异性引物序列应符合表 A.1 的要求。表 A.1特异性引物序列引物种类引物名称特异性引物的核苷酸序列片段长度水牛特性引物C15-CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAA-3220bpB15-TTTCATAATAACTTTCGTGTTGGGTGT-3牛属特性引物C15-CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAA-3346bpB25-TAAATAGGGTTAGATGCACTGAATCCAT-3B.2 PCR 检测结果电泳图示以水牛特异性引物和牛属特异性引物进行双重PCR的电泳图图 A.21 PCR检测结果琼脂糖凝胶电泳图示M、标准 DNA 分子量（100 bp ladder DNA marker）；1、阳性掺入对照； 2、纯水牛乳或纯水牛乳制品； 3和6、非水牛乳或非水牛乳制品； 4、掺假水牛乳或掺假水牛乳制品； 5、阴性掺入对照； 7、阴性质控对照。 附录C （规范性附录）试剂的配制C.1 1 mol/L PBS (pH 7.4) 的配制1 mol/L PBS (pH 7.4) 按下列方法进行制备： 氯化钠：8.0g； 氯化钾：0.2g； 磷酸氢二钠：1.42g； 磷酸二氢钾：0.27g； 双蒸水：定容至 1 000mL；在 800 mL 双蒸水中依次加入上述成分，用 1moL/L 盐酸调节溶液的pH值至7.4，加水定容至1 000 mL，1.034105 Pa 高压灭菌 25 min。室温保存。C.2 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 的配制 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 按下列方法进行配制： 二水乙二胺四乙酸二钠 (EDTA-Na22H2O)：186.1 g； 氢氧化钠：20.0 g； 双蒸水：定容至1 000 mL；在 800 mL 双蒸水中加入 186.1g EDTA-Na22H2O，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用氢氧化钠调节溶液pH值至8.0(约需 20.0 g 氢氧化钠颗粒)，然后定容至 1 000 mL，分装后 1.034105 Pa 高压灭菌 30 min。室温保存。C.3 10% SDS 的配制10% SDS 按下列方法进行配制： 十二烷基硫酸钠 (SDS)：100.0g； 双蒸水：定容至1 000 mL；在 900 mL 双蒸水中溶解 100.0 g 电泳级SDS，加热至68 助溶，用 1 moL/L盐酸调节溶液的pH值至7.2，加水定容至1 000mL，分装备用。室温保存。C.4 20mg/mL 蛋白酶K的配制20 mg/mL 蛋白酶K按下列方法进行配制： 蛋白酶K：200.0 mg； 双蒸水：定容至10 mL；将 200.0 mg 蛋白酶K加入9.5mL 的水中(为了减少变性，须加蛋白质于水中，而非加水于蛋白质中)，轻轻地摇动紧盖的管子，直到蛋白酶K完全溶解为止。定容至终体积10 mL。用0.22 m孔径滤膜过滤除菌，分装成小份于-20 贮存。C.5 3 mol/L NaAc 的配制3 mol/L NaAc 按下列方法进行配制： NaAc：257.5g； 双蒸水：定容至1 000 mL；在 800 mL 双蒸水中加入 257.5g NaAc，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，调节溶液 pH 值至8.0，然后定容至1 000 mL，分装后 1.034105 Pa 高压灭菌 30 min。室温保存。 C.6 TE 的配制TE 按下列方法进行配制： 100 mmol/L Tris-Cl PH 7.6； 10 mmol/L EDTA pH 8.0；分装后 1.034105 Pa 高压灭菌 30 min。室温保存。C.7 100mmol/L Tris-Cl pH7.6的配制100mmol/L Tris-Cl pH7.6按下列方法进行配制： Tris碱：12.11 g； 双蒸水：定容至 100 mL；在 80 ml 双蒸水中加入 12.11g Tris 碱，待溶液冷至室温后，加入浓盐酸调 PH 值至7.6，然后定容至 100 ml，分装后 1.034105 Pa 高压灭菌 30min。室温保存。C.8 Tris-硼酸电泳缓冲液的配制C.8.1 5 倍Tris-硼酸电泳缓冲液的配制 5 倍 Tris-硼酸电泳缓冲液按下列方法进行配制： Tris：54.0g； 硼酸：27.5g； 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)：20 mL； 双蒸水：定容至 1 000mL。室温保存。C.8.2 1 倍 Tris-硼酸电泳缓冲液的配制 1 倍 Tris-硼酸电泳缓冲液按下列方法进行配制： 5倍 Tris-硼酸电泳缓冲液：100 mL； 双蒸水：400 mL。室温保存。附录D （规范性附录）用酚-氯仿-异戊醇法提取DNA的步骤D.1 样品的收集按照6.1；D.2 根据最终离心获得的沉淀量，每200mg沉淀量加入1mL的消化缓冲液，同时加入蛋白酶K至终浓度为100g/mL,轻柔混匀后置于60水浴120min，不时旋转粘滞的溶液；注：在提取酸奶和干酪DNA的过程中，如果使用蛋白酶K消化后，所得溶液比较浑浊的话，再次添加相同量的蛋白酶K，并延长一倍的孵化时间，以确保蛋白消化完全。D.3 冷却至室温，2500rpm/mim离心5min后取1000L上清液到一新的2mL EP管中，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（苯酚：氯仿：异戊醇=25：24：1），充分混匀，室温静置10min，12000rpm/min，离心15min；D.4 取800L上清液到一新的2mL EP管中，加入等体积的氯仿-异戊醇（氯仿：异戊醇=24：1），充分混匀，室温静置3min，12000rpm/min，离心10min；D.5 取700L的上清于一新的1.5mL EP管中，加0.7倍体积的异丙醇和1/10体积的3 mol/L NaAc，充分混匀后置于-20沉淀DNA半小时以上；D.6 12000rpm/min，4离心15min收集沉淀，小心倾去上清后加入1mL的75%乙醇洗涤沉淀2次；D.7 室温下晾干沉淀后加入适量的TE溶解沉淀，-20保存备用。附录E （规范性附录）1.5% 琼脂糖凝胶的制备E.1 将凝胶托架两端用胶带封闭并水平放置在工作台上，放上梳子，使梳齿下沿距托架板 0.5mm 1.0mm。E.2 配制足够量的凝胶：称取 1.5g 琼脂糖于三角瓶中，加入100mL 1 倍Tris-硼酸电泳缓冲液，加热溶解琼脂糖。E.3 待琼脂糖溶液冷至 50 时，加入核酸染料GelRed 10L，充分混合(避免起泡)。将胶液沿托架胶板边缓慢连续注入，让胶液自由流向各方，凝胶厚度控制在3mm5mm之间。待凝胶完全凝固后，撤去两端胶带。E.4 将托架放入电泳槽中，加入 1倍 Tris-硼酸电泳缓冲液，使之浸过胶面 2 mm，拔出梳子，以备加样电泳待琼脂糖溶液冷至 50 时，加入核酸染料GelRed 10L，充分混合(避免起泡)。将胶液沿托架胶板边缓慢连续注入，让胶液自由流向各方，凝胶厚度控制在3mm5mm之间。待凝胶完全凝固后，撤去两端胶带。E.5 将托架放入电泳槽中，加入 1倍 Tris-硼酸电泳缓冲液，使之浸过胶面 2 mm，拔出梳子，以备加样电泳。E.6