基因工程ppt课件

专题1 基因工程,基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。,1,基础理论 和技术的发展 催生了基因工程,阅读课本第2页,2,1.1 DNA重组技术的基本工具,是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切” 和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的新的生物类型和生物产品。,分析概念：,工 具,为什么 要加工,什么是 表达,用什么 导入,3,基因操作的工具,基因的剪刀（分子手术刀） 限制性核酸内切酶（限制酶） 基因的针线（分子缝合针） DNA连接酶 基因的运输工具（分子运输车） 运载体,到哪里去寻找这种酶,4,（1）限制酶,分布：主要在原核生物中。 作用特点:专一性，识别特定核苷酸序列，切割特定切点。 结果：产生黏性末端和平末端 举例：EcoR限制酶、Sma限制酶,与我们学过的DNA酶相同吗？,作用是什么？,切断的是什么键？,识别序列的特点,两者的区别？,两种酶切的特点？,5,（2）DNA连接酶,连接的部位：磷酸和脱氧核糖之间的键： 磷酸二酯键（梯子的扶手） 结果：两个相同的未端的连接。 举例：Ecoli DNA连接酶 T4 DNA连接酶,二者在性质 上的区别？,与DNA聚合酶相同吗？,6,（3）运载体,作用：将外源基因送入受体细胞。 具备的条件： 能在宿主细胞内复制，并稳定地保存 具有多个限制酶切点 具有某些标记基因 对受体细胞无害 举例：质粒、噬菌体 和动植物病毒。,为什么 要具备 这些条件？,7,电泳：,1、概念,带电粒子在电场作用下发生迁移的过程,2、原理,在电场的作用下，这些带电分子会向着一定的电极方向移动，通过凝胶或介质时发生分离。,许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电,8,2、凝胶：溶胶或溶液中的胶体粒子或高分子在一定条件下互相连接，形成空间网状结构，结构空隙中充满了作为分散介质的液体。,9,例：现有一长度为3000碱基对(bp)的线性DNA分子，用限制性核酸内切酶酶切后，进行凝胶电泳，使降解产物分开。用酶H单独酶切，结果如图l。用酶B单独酶切，结果如图2。用酶H和1酶B同时酶切，结果如图3。该DNA分子的结构及其酶切图谱是（ ）,A,10,1.2基因工程的 基本操作程序,为什么要获得目的基因,为什么要把目的基因 与载体结合,受体细胞是指什么,为什么要进行检测,11,第一步：获取目的基因,1.从基因文库中获取目的基因。 2.利用PCR技术合成DNA 3.采用DNA合成仪人工合成长度不是很大的DNA片段。,方法：,12,1.从基因文库中获取目的基因。 基因文库和部分基因文库的慨念：,将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。,基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库。,基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库。如：cDNA文库。,13,基因文库的构建模式图,通过对 受体菌的培养而储存基因,14,2.利用PCR技术合成DNA,PCR:聚合酶链式反应。是以DNA复制、DNA变性的某些特性为原理设计的。（前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物。）,15,16,3,5,5,3,3,5,3,5,17,PCR的过程,（1）以DNA 片段作模板，在 90 高温下，分开成 为单链DNA。 高温的作用是？ （2）以DNA 小段寡聚核苷酸做引物，在 50 的温度下，找到可以配对的正链和负链，形成互补结合。 （3）在 70 高温下，合成一条与模板 DNA 单链（正链或负链）互补结合的DNA新链。 （4）以上三个步骤周而复始，即反应体系的温度从 90oC 50oC75oC，目的基因的量不断增加。 反应体系中经历：变性淬火合成重复 。 结果：目的基因的量成指数形式扩增（2n）,四种脱氧核苷酸三磷酸（4 X dNTP),原料,引物是怎样获得的？,酶：,高温 DNA 聚合酶（Taq 酶）,18,第二步： 基因表达载体的构建,核心,需要 哪两种 工具,目的基因与载体结合成的重组DNA,19,总结：表达载体需由哪几部分组成,复制原点 启动子 目的基因 终止子 标记基因,它们的作用是？,20,若实验操作中有大量材料存在，用同一种限制酶切割后再连接时，会有几种连接形式（产物）？,目的基因和目的基因连接物 载体和载体连接物 目的基因和载体连接物,21,第三步：将目的基因导入受体细胞,1.将目的基因导入植物细胞 2.将目的基因导入动物细胞 3.将目的基因导入微生物细胞,什么叫转化,常用的转化方法有哪些？,具体过程？,1.转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。,22,（1）农杆菌转化法：双子叶植物和裸子植物。,1.将目的基因导入植物细胞,（3）基因枪法：单子叶植物。,（2）花粉管通道法：双子叶植物。,23,（1）农杆菌转化法：,过程,Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,（可编码限制酶和DNA连接酶）,24,花粉管通道法：,将目的基因导入植物细胞,操作方法：,特点：,在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞,十分简便经济,例：,转基因抗虫棉,25,基因枪法：,利用压缩气体产生的动力 ，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法,操作方法：,金属粒：,将目的基因导入单子叶植物细胞,钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.64um 。,26,细胞类型：,操作程序：,_显微注射法：,（2）将目的基因导入动物细胞,发育成新性状动物,移植到子宫或输卵管,培养成早期胚胎,显微注射,取受精卵,提纯含目的基因表达载体,受精卵,27,常用法：,常用菌：,微生物作受体细胞原因：,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,大肠杆菌,Ca2+处理获得感受态细胞,Ca2+处理 大肠杆菌,感受态 细胞,表达载体 与感受态 细胞混合,感受态细胞 吸收DNA,_感受态细胞法：,（3）将目的基因导入微生物细胞,28,第四部 目的基因的检测与鉴定 检查是否成功,检测方法：,1、分子水平的鉴定：,（1）DNA分子与DNA分子的之间杂交,（2）DNA分子与RNA分子的之间杂交,（3）蛋白质分子（抗原与抗体）之间杂交,2、个体生物学水平的鉴定：,抗虫、抗病结种实验，活性比较实验,29,转基因生 物的DNA,探针,15N,15N,14N,14N,（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了 目的基因,基因探针：,放射性同位素等标记的DNA分子,方法,DNA分子杂交技术,变性,变性,基因探针：核酸分子探针是指特定的已知核酸片段，能与互补核酸序列杂交。 满足： （1）单链（2）带有容易被检测出来的标记物。,30,变性,方法,DNA分子杂交技术,（2）检测目的基因是否转录出了mRNA,探针,15N,15N,转基因生物 的mRNA,14N,14N,31,提取,（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法抗原-抗体杂交,Bt毒素蛋白,将Bt毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体,抗体,蛋白质 （抗原）,出现杂交带 （特异性结合）,脱分化,组织培养,证明：提取蛋白质与Bt毒素蛋白质一样,32,例1:线性DNA分子的酶切示意图,已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指，如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。现有多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是 A3 B4 C9 D12,线性DNA分子的酶切示意图,33,例2:下列所示的黏性末端是由几种限制性内切酶作用产生的 A1种 B2种 C3种 D4种,34,例3 :限制性内切酶能识别特定的DNA序列并进行剪切，不同的限制性内切酶可以对不同的核酸序列进行剪切。现以3种不同的限制性内切酶对6.2kb大小的线状DNA进行剪切后。用凝胶电泳分离各核酸片段，实验结果如右图所示：请问：3种不同的限制性内切酶在此DNA片段上相应切点的位置是（ ）,35,36,1、3 基因工程的应用,请继续把表格完成,37,38,39,1、4蛋白质工程的崛起,蛋白质工程的概念 是研究蛋白质的结构及结构与功能的关系，然后人为地设计一个新蛋白质，并按这个设计的蛋白质结构去改变其基因结构，从而产生新的蛋白质。 或者从蛋白质结构与功能的关系出发，定向地改造天然蛋白质的结构，特别是对功能基因的修饰，也可以制造新型的蛋白质。,40,一、蛋白质的改造,干扰素在体外保存困难 玉米中赖氨酸含量比较低,将分子中的一个半胱氨酸转变成丝氨酸,第104位的天冬酰胺变成异亮氨酸,第352位的苏氨酸变成异亮氨酸,41,二、蛋白质工程的基本原理,遵循中心法则，并需经过高级空间结构的转变,天然蛋白质的合成过程时怎样的？,42,蛋白质工程的途径,预期蛋白质功能,设计蛋白质结构,推测氨基酸序列,相应的脱氧核苷酸序列（基因）,投入生产,依赖于什么工程,根据什么预期,包括哪些方面的结构,依据是什么,43,讨论：某多肽链的一段氨基酸序列是： 丙氨酸色氨酸赖氨酸甲硫氨酸苯 丙氨酸 （1） 怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？请把相应的碱基序列写出来。有多少种？ （2） 确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因（DNA）？,44,45,（1） 怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？请把相应的碱基序列写出来。有多少种？ （2） 确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因（DNA）？,mRNA序列为： GCU（或C或A或G）UGGAAA（或G）AUGUUU（或C）,脱氧核苷酸序列： CGA（或G或T或C） ACCTTT （或C）TACAAA （或G）,16种,确定目的基因的碱基序列后，就可以根据人类的需要改造它，通过人工合成的方法或从基因库中获取。,46,蛋白质工程操作程序的基本思路与 基因工程的不同,基因工程是遵循中心法则，DNAmRNA蛋白质折叠产生功能，生产出自然界已有的蛋白质。 蛋白质工程是：确定蛋白质的功能蛋白质应有的高级结构蛋白质应具备的折叠状态应有的氨基酸序列应有的碱基排列，创造自然界不存在的蛋白质。,47,蛋白质工程的进展和前景,1、蛋白质工程的诞生是有其理论与技术条件的，它是随着分子生物学、晶体学以及计算机技术的发展而诞生的，与基因组学、蛋白质组学、生物信息学的发展等因素有关 2、现状：成功的例子不多，主要是因为蛋白质发挥其功能需要依赖于正确的空间结构，而科学家目前对大多数蛋白质的空间结构了解很少。,48,酶工程简介,酶工程就是指将酶所具有的生物催化作用，借助工程学的手段，应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护等方面的一门科学技术。由酶制剂的生产和应用两方面组成的。,酶工程通常是用工程菌生产酶制剂，重点在于对已存酶 的合理充分利用。 蛋白质工程的重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造。 随着蛋白质工程的发展，其成果也会应用到酶工程中，使酶工程成为蛋白质工程的一部分。,49,限制酶的识别特点,中轴线双侧的DNA上碱基呈反向对称，重复排列 如：GAA TTC CCC GGG CTT AAG GGGCCC,50,磷酸二酯键,磷酸二酯键,51,Hin d限制性酶,目的DNA,Ti质粒,苏云金杆菌,构建表达载体,Bt毒素蛋白基因,DNA连接酶,T-DNA (可转移-DNA),抗虫棉的操作过程：,获取目的基因,52,脱分化,组织培养,脱分化,导入植物细胞通过组织培养产生新个体,再分化,移植,个体生物学水平的鉴定,如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达,导入植物细胞,组织培养,53,培养,培养,导入,含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌【活性比较】,含有氨苄青霉素 的完全培养基,不能存活,Ca2+ 处理细胞形成感受态细胞,（不具有氨苄青霉素抗性基因的农杆菌）,不具有氨苄青霉素抗性基因的农杆菌,完全培养基,具有氨苄青霉素抗性基因的农杆菌,54,