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实验四：线粒体和细胞核的制备与观察 一、实验目的 1.对分离得到的细胞核及线粒体进行活性鉴定。 2.掌握用差速离心技术分离制备动植物细胞核及 线粒体的方法。,1,二、实验原理 线粒体是真核细胞特有的进行能量转换的重要细胞器。将动植物组织制成匀浆，在适当的悬浮介质中差速离心法可以分离细胞线粒体。在一定的离心场中（选用离心机的一定转速），球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一均匀的悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器沉降先后顺序是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。,2,差速离心技术：利用细胞核与线粒体在一定介质中的沉降速度的差异，可采取分级差速离心的方法，将细胞核与线粒体逐级分离出来。 悬浮介质通常采用缓冲的蔗糖溶液，它较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性；pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易聚集成团，有利于分离。整个操作过程样品要保持在0-4，避免酶失活。,3,细胞器标记酶的测定是评价细胞器内膜组分和分离纯度的主要依据，如线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶，该酶使詹纳斯绿B染料保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。,4,詹纳斯绿B是一种活体染料，能对动植物的细胞或组织在活体状态下进行无毒害的染色。由于染料（碱性染料）的胶粒表面带有阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染部分本身具有阳离子或阴离子，这样，它们彼此之间发生吸引作用，染料就被堆积下来。染色法可以显示出活细胞内的某种天然结构存在的真实性，且不影响细胞的生命活动。 Gimesa是一种复合染料，即为酸性染料与碱性染料的结合物。在水溶液中电离为带正电和负电的染料离子。,5,三、实验材料、用品 1. 器材： 解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃匀浆器，尼龙织物，离心管，显微镜，冷冻高速离心机等。 2. 材料： 兔肝脏, 玉米黄化苗,6,3. 试剂： (1) 0.25mol/L蔗糖-0.01mol/L三羟甲基氨基甲 烷(Tris)-盐酸缓冲液(pH7.4) (2) 1%詹纳斯绿B(Janus green B)染液。 (3) 姬姆萨染液（Giemsa）。 (4) 1/15 mol/L磷酸缓冲液（pH6.8） (5) 卡诺（Cornay）固定液。 (6) 生理盐水,7,四、实验步骤 (一) 兔肝细胞线粒体及细胞核的分离 （动物材料） 1.制备肝细胞匀浆： 实验前将白兔空腹12小时，脱臼处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干水，称取肝组织0.3g，剪碎；用预冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗涤数次。然后加1.5 ml预冷的0.25mol/L蔗糖溶液，分数次添加蔗糖溶液，冰浴中用玻璃匀浆器将肝制成匀浆，肝匀浆用双层纱布过滤(滤液制两张涂片).,8,9,涂片过程：,10,3. 分离物鉴定： （1） 细胞核：将涂片（不加盖玻片）自然干燥后加入Carnoy固定液15min，晾干。Giemsa染液染10min，蒸馏水漂洗数秒，用滤纸吸干水，用显微镜（40）检查，细胞核呈紫红色，混杂的细胞质为浅蓝色碎片。 （2） 线粒体：取线粒体沉淀滴在载玻片上，得涂片，勿太密。滴加1-2滴1%詹纳斯绿B溶液染色，10分钟后加盖玻片，吸水纸吸走多余染料，用光学显微镜观察，线粒体呈蓝绿色，小棒状或哑铃状。,11,(二) 玉米线粒体及细胞核的分离（植物材料） 从植物细胞分离线粒体，除了作线粒体功能研究外，在植物细胞遗传工程中，常用于分离核外基因线粒体DNA等目的。 分离线粒体的方法仍采用均匀介质中的差数离心。介质中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L甘露醇代替。EDTA螯合二价阳离子，Ca2+除去后细胞间粘着解体，促使组织分散成单个细胞。牛血清白蛋白（BSA）能包在细胞外面，并作为竞争性底物削弱蛋白酶的作用。,12,1.试剂 1）分离介质：0.25mol/L蔗糖，50mmol/L的 Tris-HCl缓冲液（pH7.4），3 mmol/L EDTA，0.75 mg/ml BSA。 2）保存液：0.3 mol/L 甘露醇（pH7.4）。 3）20% NaClO溶液。 4）1% 詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。 2.器材 剪刀，漏斗，研钵，纱布，离心管，显微镜，冷冻高速离心机等。,13,3.实验方法 1）剪取12cm长的幼苗黄化苗0.5g，剪碎；加2.0 ml预冷的分离介质，冰浴上研磨成匀浆。 2）匀浆用双层纱布过滤(滤液制两张涂片). 3）滤液700g离心10分钟，除去核和杂质沉淀。 4）上清夜10000g离心15分钟，沉淀为线粒体制涂片 5）涂片未干时，立即滴加1% 詹纳斯绿B染液，染色10分钟，盖上盖玻片，用显微镜观察，线粒体是蓝绿色圆形颗粒。,14,五、实验结果 光学显微镜观察，线粒体呈蓝绿色，小棒状或哑铃状。,15,六、实验报告 1.分别描述2张细胞核涂片的结果(如平均每个视野中 所见完整的细胞核数量，完整的细胞或带有残留细 胞质的细胞核的约占多少等) 2.分别描述鼠和水稻黄化苗的两张线粒体装片的观察 结果,根据你的实验结果,你认为所分离的线粒体的 纯度如何? 3.绘图：动物材料涂片，植物材料涂片，并 比较动物和植物线粒体的差异。,16,
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