小反刍兽疫恒温扩增检测技术规范

ICS11.220B 41DB37山东省地方标准DB37/T XXXXXXXXX小反刍兽疫恒温扩增检测技术规范Technical specification for isothermal amplification of Peste des petits ruminantsXXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施山东省市场监督管理局发布DB37/T XXXXXXXXX前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东师范大学、山东省农业科学院、中国动物卫生与流行病学中心、杭州众测生物科技有限公司、桂林市临桂区动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：陈蕾、孙文博、吴晓东、陈艳如、廖炳次、蒋文明、李华、刘腾腾、杨慧婷、单世娟、陈秋红、孙晓洁、杨桂文。7小反刍兽疫恒温扩增检测技术规范1 范围本标准规定了小反刍兽疫（PPR）的恒温核酸扩增检测技术的要求。本标准适用于小反刍兽疫的快速检测、诊断、检疫、监测和流行病学调查。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB 194892008实验室生物安全通用要求NY/T 5412016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3 原理核酸恒温扩增技术是依赖解旋酶解开双链DNA，再依赖单链DNA结合蛋白与模板单链结合，使模板单链处于单链状态并保护它的完整性。引物与模板杂交，然后在DNA聚合酶的催化下扩增。4 试剂或材料除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。4.1 水：符合GB/T 6682中规定的一级水。 4.2 1PBS溶液（pH值7.4）配制见附录A.1。 4.3 核酸提取试剂：a) Trizol；b) 氯仿；c) 75 %乙醇；d) 异丙醇。4.4 恒温扩增试剂盒。4.5 不含RNA酶的水：DEPC处理过的不含RNA酶的水。4.6 恒温扩增检测引物：恒温扩增检测引物表B.1。4.7 无水乙醇。4.8 微量移液器配套的带滤芯吸头。4.9 离心管：1.5 mL。5 材料及设备主要仪器设备：a) 微量移液器：10 L、20 L、100 L、1 000 L；b) 高速台式离心机：离心力8 000 g；c) 生物安全柜；d) 冰箱；e) 涡旋振荡器；f) 研磨管；g) 荧光定量PCR仪；h) 天平：感量为0.001 g。6 样品6.1 基本要求应符合GB 194892008和NY/T 5412016中关于实验室生物安全和兽医诊断样品采集、保存与运输的要求。6.2 样品采集6.2.1 棉拭子样品无菌采集羊口鼻棉拭子。6.2.2 组织样品无菌采集病死羊的淋巴结、脾、胸腺、肠粘膜和肺等组织样品。2 8 低温运至实验室用于检测。6.2.3 环境样品采集与病羊相关场所的粪便、饲料、污水样品。2 8 低温运至实验室。6.3 样品处理方法6.3.1 口鼻拭子样品处理口鼻拭子管6 000 g震荡45秒，取200 L进行核酸提取。6.3.2 淋巴结、脾、胸腺等组织样品处理取0.05 g组织块放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，6 000 g震荡研磨45秒，制成约10 %的组织匀浆液，5 000 g离心5 min，取200 L上清液进行核酸提取。6.3.3 粪便、饲料样品处理取1 g的粪便、饲料放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，6 000 g/min震荡研磨45秒，制成约10 %的匀浆液，5 000 g/min离心5 min，取200 L上清液进行核酸提取。6.3.4 污水样品处理取200 L污水进行核酸提取。7 操作步骤7.1 RNA的提取Trizol法7.1.1 取6.2处理后的样品向处理好的300 L组织样品或血清中加入800 L Trizol，重复吹打以裂解细胞（或者剧烈振荡），冰上放置10 min25 min。7.1.2 加入氯仿200 L，用力振荡30 s，室温放置5 min。7.1.3 4 ，8 000 g 离心15 min，吸取上层液体500 L于1.5 mL离心管中。7.1.4 加入1.0 mL异丙醇，-20 沉淀RNA至少1 h。7.1.5 4 8 000 g离心10 min，弃上清，用75 %的乙醇洗涤沉淀，8 000 g离心5 min，彻底弃去上清，自然条件下干燥沉淀，溶于50 L DEPC处理的灭菌水中，-20 贮存，备用。也可选择市售商品化RNA提取试剂盒，完成RNA的提取。7.2 恒温核酸扩增 设50 L恒温核酸扩增反应体系，详见附录B.2。7.3 检测每次反应设置阳性、阴性对照，具体反应程序见表B.3。8 结果判定8.1 结果判读见表1。表1 结果判定序号通道Ct值结果判断1FAMUNDET或40样本低于检测限，报告为阴性2FAM37判定为阳性3FAM37-40复检一次，如仍为37-40，则判定为阴性8.2 阴性对照和阳性对照，有任一结果异常，需要重新检测。8.3 结果参考图谱：见附录C。AA附录A （规范性附录）试剂的配制1PBS溶液(pH值7.4)：a) 磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27 g；b) 磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42 g；c) 氯化钠(NaCl)：8 g；d) 氯化钾(KCl)：0.2 g。加灭菌水约800 mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH值至7.4，最后定容到1 L。BB附录B （规范性附录）恒温核酸扩增引物、反应液体系与反应条件B.1 恒温核酸扩增引物见表B.1。表B.1 恒温核酸扩增引物引物序列PRRV-F5- ATCCAACTCTCAAGTACAGCGTTACTATGTTTATA -3PRRV-R5- TCCACATCGCTGTCGTCAGATCCATCCTCTCCT -3PRRV-Probe5- GTGAAGAGATTGAAGGACTCGAGGATGCTGAC (FAM-d T) (THF) (BHQ1-d T) CTCGTGGTTCAAGCA-C3 spacer -3注： F为FAM荧光基团标记、T为THF、B为BHQ1粹灭基团标记、3末端为C3 Spacer标记。B.2 恒温核酸扩增体系见表B.2。表B.2 恒温核酸扩增体系组分用量LDEPC水25.4A Buffer12.510 M PRRV-F210 M PRRV-R210 M PRRV-Probe0.6模板RNA5B Buffer2.5涡旋混合并离心上述溶液，装有干粉的反应管用移液器上下吹打直至干粉溶解完全并混合均匀。B.3 恒温核酸扩增反应条件见表B.3。表B.3 恒温核酸扩增反应条件反应条件反应温度39 C循环数40信号采集每30 s反应时间20 minCC附录C （资料性附录）小反刍兽疫恒温扩增检测结果判读阴性对照和阳性对照见图C.1。图C.1 阴性对照和阳性对照样品检测见图C.2。图C.2 样品检测_