鸡CpG寡脱氧核苷酸疫苗佐剂制备技术规程

ICS11.220B 41DB37山东省地方标准DB37/T XXXXXXXXX鸡CpG寡脱氧核苷酸疫苗佐剂制备技术规程Preparation technique of CpG oligonucleotide adjuvant for chicken vaccinesXXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施山东省市场监督管理局发布DB37/T XXXXXXXXX前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所、齐鲁师范学院、山东润达检测技术有限公司。本标准主要起草人：张琳、吴家强、朱广伟、黄艳艳、于江、张玉玉、许传田、艾武、张秀美、刘军伟。3鸡CpG寡脱氧核苷酸疫苗佐剂制备技术规程1 范围本标准规定了鸡特异性CpG寡脱氧核苷酸疫苗佐剂的制备、检测、贮存等方面的技术规程。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 66822008分析实验室用水规格和试验方法3 术语与定义下列术语和定义适用于本文件。3.1CpG寡脱氧核苷酸CpG oligonucleotide，CpG ODN含有未甲基化的CpG二核苷酸基序的核酸序列，能够在机体内诱导强烈的免疫反应。3.2硫代修饰phosphorthioate modified将核酸序列磷酸二酯键中的非桥氧原子置换成硫原子，主要用于防止反义实验中核酸被核酸酶降解。3.3熔解温度melting temperature，Tm在DNA双螺旋结构热变性过程中紫外吸收值达到最大值的1/2时的温度。3.4聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收、纯化目的DNA。3.5OD值optical density value表示被检测物吸收掉的光密度，是检测方法里的专有名词，检测单位用OD值表示。4 试剂或材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯。4.1 水：符合GB/T 66822008一级水规定。4.2 三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(TE)缓冲液：附录A.1。4.3 生理盐水。4.4 去内毒素质粒大提试剂盒。5 仪器设备5.1 微量移液器：2.5 uL、10 uL、200 uL、1 000 uL。5.2 高速离心机：离心力13 000转/分钟。5.3 无菌注射器：1 mL、5 mL。5.4 冰箱：低于-20 。5.5 紫外分光光度计：波长范围200 nm380 nm。5.6 超净工作台或生物安全柜。5.7 天平：精度0.1 mg。5.8 滤器：0.45 um。5.9 恒温摇床：振荡频率10400转/分钟，温度范围为室温70 。6 佐剂的制备6.1 单链形态佐剂的制备鸡种属特异性CpG ODN序列：5-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT-3，全链或两端硫代修饰，分子量6782.43 g/mol，Tm值58.01。序列由生物公司合成，采用PAGE及以上纯化方式纯化，建议合成量20 OD/管，分装2管。6.2 双链形态佐剂的制备6.2.1 重组质粒的构建6.2.1.1 目的片段为含8拷贝鸡种属特异性CpG ODN序列（同6.1）的基因片段。目的片段 5端添加Sal I酶切位点（gtcgac），3端添加Xho I酶切位点(ctcgag)，单拷贝序列间以碱基CTAGA连接。目的片段和原核表达质粒pET21a分别经Sal I和Xho I内切酶双酶切后，使用T4 DNA连接酶进行重组连接。6.2.1.2 将重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞DH5中，在LB固体培养基（附录A.2）平板上37 倒置培养约812小时后，挑取单克隆菌落至LB液体培养基（附录A.3）中，37 条件下进行摇动过夜培养。6.2.2 重组质粒的提取6.2.2.1 用去内毒素质粒大提试剂盒进行重组质粒的提取。提取操作参照试剂盒说明书进行。6.2.2.2 用0.45 um的滤器过滤提取质粒，去除细菌、蛋白等杂质。纯净的双链重组质粒形态稳定，无需硫代修饰。7 检测7.1 单链形态合成产品取一支CpG ODN佐剂合成品(含10 OD CpG ODN)放入高速离心机，12 000转/分钟离心35分钟，加水5 mL，溶解混匀后取100 uL，加入光径为1 cm的石英比色杯，然后加入900 uL水，混匀后用紫外分光光度计测定260 nm处的数值，如为0.2证明CpG ODN含量正常，如低于0.2说明CpG ODN含量过低，合成量不足。7.2 双链形态重组质粒取CpG ODN重组质粒20 uL，加入980 uL水对质粒样品进行50倍稀释后加入光径为1 cm的石英比色杯， 用紫外分光光度计分别测定260 nm和280 nm处的数值，当OD260/OD280在1.81.9之间时，且根据质粒浓度计算公式得出的重组质粒浓度高于1 500 ug/mL时方可应用。其中，质粒浓度计算公式为50OD260值稀释倍数（单位为ug/mL）8 贮存8.1 单链形态合成产品8.1.1 CpG ODN合成产品为干膜状物质，长期贮存应在-20 以下。8.1.2 已用水或TE缓冲液溶解配制的CpG ODN佐剂应尽快使用完毕，短期-20 以下冷冻保存，避免反复冻融。8.2 双链形态重组质粒CpG ODN重组质粒溶解于水后应于-20 以下冷冻保存，避免反复冻融，有效期不超过12个月。9 操作注意事项9.1 CpG ODN佐剂的制备产品和贮存应保证无菌。9.2 CpG ODN重组质粒的转化和培养应保证无外源菌感染。9.3 CpG ODN合成产品呈无色干膜状，质轻，打开时极易散失，故开盖前需离心。9.4 CpG ODN佐剂现用现配（制备），尽快用完，以减少核酸的降解。10 说明10.1 本标准规定的CpG ODN佐剂可用于疫苗生产企业生产疫苗和养殖企业稀释疫苗。10.2 本标准规定的CpG ODN佐剂可用于鸡用冻干疫苗和液体疫苗。AA附录A （资料性附录）试剂的配制A.1 TE缓冲液1TE缓冲液1 L中含1 M 三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH 8.0） 10 mL0.5 M 乙二胺四乙酸（pH 8.0） 2 mL加水定容至 1 L，高压灭菌，室温保存。A.2 LB固体培养基1L LB固体培养基中含胰蛋白胨 10 g酵母提取物 5 g氯化钠 10 g琼脂粉 15 g加水950 mL，溶解后用1M的NaOH调节pH值到7.0，定容至1 L，高压灭菌，待冷却至50 60 时，加入1 mL氨苄青霉素（100 mg/mL）后混合均匀，倒制平板。A.3 LB液体培养基1L LB液体培养基中含胰蛋白胨 10 g酵母提取物 5 g氯化钠 10 g加水800 mL，溶解后用1 M的NaOH调节pH值到7.0，定容至1 L，高压灭菌，冷却至室温，加入1 mL氨苄青霉素（100 mg/mL）后混合均匀。_