工业用溶菌酶行业标准简要编制说明

工业用 溶菌酶 行业标准 简要 编制说明 一、 工作简况 （一）任务来源、起草单位、起草人 本标准由中国食品发酵工业研究院组织上报，被列入工业和信息化部 2012 年行业标准制修订计划， 计划名称为工业用溶菌酶， 项目编号 2012本标准由中国轻工业联合会提出， 全国食品 标准化中心 归口 。 本标准主要起草单位略。本标准主要起草人略。负责标准技术资料查询、收集及对比，检测方法的验证比对，样品检测及数据整理，标准文本及编制说明的起草、撰写，行业内征求意见，组织标准的初审讨论会及标准报送等。 （二）简要起草过程 标准任务下达后，中国食品发酵工业研究院针对制定工业用溶菌酶行业 标准的具体工作进行了认真研究，确定了总体工作方案， 于 2012 年 12 月组建了标准起草工作组 。起草工作组 首先 查阅相关的国内外技术标准资料，在参照国际和国外先进标准的基础上，结合目前国内市场产品的实际情况，初步确定了产品的质量技术指标和相应的试验方法，形成了标准草案 （第一稿） 。 2013 年 5 月，工作组在北京召开 第一次 讨论会对标准草案进行讨论研究， 综合各方意见，对一些尚存在异议的内容进行进一步整理 ， 修改成 标准草案 （第二稿），同时 确定了进一步的对比验证工作 ， 2013 年 6 月 2014 年 4 月，起草组完成样品的搜集，测定底物、标准品的购置、转化及试验方法的验证调整工作。 2014 年 5 月，工作组在北京召开 第二次 讨论会 ， 经过大家的认真、细致的讨论研究，对标准中涉及的主要关键问题达成共识， 会后 又经 多次 沟通研究，并 于 2015 年 11 月 修改 形成征求意见稿，向行业内公开征集意见 。 二、 对主要条款的说明 （ 一 ） 主要内容 据起草工作组调研和查阅，目前 菌酶）和 1992）酸盐溶菌酶）、日本食品添加剂公 定书第八版 s 品添加剂溶菌酶标准规范） 及 原卫生部2010公告 均已公布了溶菌酶的质量规格 要求 。 质量规格特指盐酸盐溶菌酶； 限定蛋清来源，给出酶活力测定方法，不限工艺，也没有给出特定质量规格；日本公定书针对溶菌酶产品，工艺上涵盖原卫生部公告的溶菌酶产品，因此，本标准制定综合考虑上述质量标准给出本标准技术要求。对比情况见附表 1、附表 2。本标准的主要技术内容说明如下： 本标准编写符合 规定。 1. 酶活力 酶活力对于酶制剂产品即是性能指标也相当于鉴别指标。 据酶活力定义，直接测定计算溶菌酶活力，对活力大小没有给出限值； 对盐酸盐工艺的溶菌酶，以纯度指标表达相对酶活，并规定纯度指标 95%，原卫生部 2010公告两个指标全部规定，但酶活力指标的规定单位为企业申报的方法及单位。本标准认为活力指标与纯度指标没有必要同时设定， 活力测定方法快速、简单，不依赖于标准酶的使用，因而酶活力采纳 定义及计算，试剂的使用及溶液的配 制，考虑操作的方便，给出细微调整。 一个溶菌酶活力单位定义为 25 ， 件下，使用溶壁微球菌悬浊液在 450每分钟引起吸光度变化为 溶菌酶的量。直接采纳 活力单位定义。 2. 水分 原卫生部 2010公告， 日本公定书对溶菌酶的水分要求均限定在 6%（固体），本标准与之保持一致。检测方法采用国标 品安全国家标准 食品中水分的测定。 3. 灰分 与原卫生部公告一致固体 液体 检测方法采用国标 品安全国家标 准 食品中灰分的测定。 4. 卫生部公告值固体产品 体产品 本规定于该指标与工艺有关，且溶菌酶在酸性条件下化学性质、热稳定性均较好，且该指标与安全性无直接关系，因此本标准综合考虑 定在 范围内。溶液测定 5. 抑菌作用 在目前市场上溶菌酶有微生物发酵、蛋清提取等不同来源，来源不同抑菌 作用 也差别很大。为了确保溶菌酶的质量，在溶菌酶行业标准中，增加定性抑菌试验检测 。 抑菌环直径 6 判为有抑菌作用；抑菌环直径 6 为无抑菌作用。 2 次重复试验均有抑菌作用，判为合格。 6. 食品安全要求 应符合 国家相关 规定 。 7. 酶活力的测定 标准草稿中酶活测定方法等同转化 方法，但实验室在验证时发现直接按 法获得酶活测定结果，测定底物浓度与仪器初始浓度存在不匹配的问题，且实验过程中必须规定相关细节才能保证实验结果的准确、一致性。因此，本标准中的酶活测定方法参照 测定方法做适当调整，具体调整如下： 测定用底物：为了保证酶活测定的准确性及一致性，必须指定测定用底物，其中定使用 壁微球菌，底物配制时按干菌粉给出配制方法及初始底物溶液吸光值； 接指定 同等分析效果的产品。作为一般企业或质检机构 种购进手续繁琐，且存在被告知为国内限制购入产品而无法购得的可能。 活菌制品，价格昂贵，且为一次性使用产品，对于企业连续测定成本较高。为了便于标准发布后测定方法的有效执行，起草组委托食发院菌种中心引进 种，并接种培养配制成不同浓度，配合起草组各实验室进行 法的有效转化。起草过程中有关单位提出，菌种的接种培养及稀释度的控制专业性较强，如果直接要求菌种中心提供合适浓度的菌悬液，又存在运输困难且由于运输、储存条件的变化造成菌液不稳定的情况。因此，本标准制定也考虑自制标准测定用菌粉的可能。经实验比对，文本给出 号及对应 种编号，同时考虑给出 粉编号。日本也是制定本国菌种编号及标准酶编号。 底物溶液： 空气调分光光度计零点，底物溶液的吸光度， 450读数应为 吸光度降低的速度应在 位 /标准以磷酸盐缓冲液调分光光度计零点，然后测定底物溶液的吸光度， 450读数应为 酶活力测定步骤：增加 “3内初始吸光度值变化应小于等于 ，方可开始测定 ”，确保底物溶液的稳定且没有受到溶菌酶的污染；增加 “反应 1稳定，计算时忽略最初 1读数 ”，以保证酶活测定 在有效的线性范围内，保证酶活测定的准确性。 附表 1：国内外溶菌酶质量规格指标对照表 项目 标准 本标准 原 卫生部 2010公告 日本公定书 第八版 （溶菌酶） 992（盐酸盐溶菌酶） 范围 本标准适用于从鸡蛋清中提取、精制等工艺制得的工业用溶菌酶 用离子交换树脂从鸡蛋清中提取溶菌酶，然后经洗脱、离心过滤、低压反渗透过滤、巴氏杀菌制得液体型溶菌酶产品；将液体型溶菌酶进行喷雾干燥制得粉末型溶菌酶产品 能溶解细菌细胞壁物质的一种酶制剂，来源于蛋清，用碱性水溶液或盐溶液处理后用树脂纯化，或用柱 纯化，或树脂纯化后再结晶，或加盐处理 从鸡蛋蛋清中提取的，由 129 个氨基酸组成的多肽，分子量大约为 14000，有酶活性 ，可以水解细菌，尤其是革兰氏阳性细菌的外膜中的连接 （ 1；通常以盐酸盐型的形式获取，用于食品加工。必须符合食品加工处理所用酶制品的通用技术指标 性状 白色至淡黄色粉末；浅 黄色至深褐色液体 白色至淡黄色粉末；浅黄色至深褐 色液体 无味白色粉末 白色无味粉末 鉴别 B： 酸盐缓冲液于 279281有最大吸收 A：可溶于水，不溶于有机溶剂和浓盐溶液 B： 2500溶液，紫外吸光度值252281量测定（纯度） 95% 95% 溶液透明度 51%溶液，要时可用稀盐酸调 体） 200） 分， % 6（固体） 6（固体） 体） 6（固体） 总干物质 94%； 22%（液体） 项目 标准 本标准 原 卫生部 2010公告 日本公定书 第八版 （溶菌酶） 992（盐酸盐溶菌酶） 酶活力 符合声称 07g； 9106g 以干基计酶活性不小于 灰分 ， % 体） 体） 体） 体） 菌作用 合格 氮， % ， % 体） ， % 表 2： 国内外溶菌酶标准试验方法对照表 标准 项目 本标准 日本公定书第八版（溶菌酶） 中国药典 （ 水分 ， % 取样 胶减压 2 小时 减压干燥 酶活力 修改采用始吸光度 照药典） 比浊法，以溶壁微球菌培养液为底物，溶菌酶可以溶解溶壁微球菌，使吸光度降低，且其降低程度与溶菌酶的活性成正比。缓冲液 25 ）底物溶液球菌浓度 304000 对照标准溶液和样品溶液浓度 1mg/将1色皿放入分光光度计，调整吸光度零点；吸 物溶液于比色皿；最初 450 准制备液加入底物溶液，充分混合。记录 3吸光度的降低，每 15s 记录一次吸光值，吸光值得变化应呈线性，每分钟的变化范围应在 复操作测定样品溶液 . 1 个溶菌酶活力单位定义为 25， 件下，使用溶壁微球菌悬浊液在 450每分钟引起吸光度变化为 溶菌酶的量。 分析 1 分钟后稳定，计算时忽略最初 1 分钟的读数。用曲线的线性部分（通常在后 2 分钟）确定每分钟吸光度变化的平均值。 精确称取相当于 50力效能的样品（以干基计）用 酸缓冲液配制成一定浓度的样品溶液；用真空干燥器烘干 标样 2 小时，精确称取相当于 50力效能的标准参考酶，用 酸缓冲液配制成一定浓度的标准溶液。准确吸取3物溶液至试管 35 预热3物溶液，样品溶液，标准溶液 35 预热 3确吸取 3热过的溶液至试管中 35 反应10640定吸光度，计算酶活力 A 00样品质量酶标准品质量活力底物悬浮液的制备 称取溶酶小球菌 3040磷酸盐缓冲液 (1研钵内研磨 3 分钟，再加磷酸盐缓冲液 (量，使总体积约为 100悬浮液于 25时，在 450波长处测得的吸收度为 用前配制 )。 测定法 精密量取 25的底物悬浮液 3 1色池中，在 450波长处测定吸收度，作为零秒的读数 A，然后精密量取 25供试品溶液 当于溶菌酶 加到上述比色池中，迅速混匀，用秒表计时 ,至 60 秒时再测定吸收度 A；同时精密量取磷酸盐缓冲液(法操作，做为空白试验，测得零秒 的读数 A及 60 秒的读数 A。 活力单位定义 在室温 25 、 ，在波长 450，每分钟引起吸收度下降 一个酶活力单位 灰分 ， % 灼烧残渣 溶液 溶液 1%水溶液 抑菌作用 抑菌环试验