禽源沙门氏菌快速检测技术

ICS65.020.30B 41DB37山东省地方标准DB37/T XXXXXXXXX禽源沙门氏菌快速检测技术Rapid detection method for avian SalmonellaXXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施山东省市场监督管理局发布DB37/T XXXXXXXXX前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东农业大学、济南百准生物检验有限公司、泰安市动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：孙淑红、朱琦、郭龙宗、唐德宏、王方昆、唐辉、张富友、鞠孜敬、崔治中。引言沙门氏菌病是由沙门氏菌所引起的急性或慢性疾病的总称。由鸡白痢沙门氏菌所引起的称为鸡白痢，由鸡伤寒沙门氏菌引起的称为禽伤寒，由其他有鞭毛能运动的沙门氏菌所引起的禽类疾病则统称为禽副伤寒。禽沙门氏菌病在世界各地普遍存在，对养禽业的危害性很大。该病同样严重危害我国的养禽业。可垂直传播和水平传播，造成种蛋孵化率、雏鸡成活率和鸡群生产性能下降等问题。当前，我国种鸡场主要流行的沙门氏菌血清型是B群和D群沙门氏菌。种禽的净化是防控该病最为有效的方法，国家为此制定了相关的检测标准，颁布了GB 4789.42016沙门氏菌检验方法，但该标准缺少简便、快速的病原学PCR检测方法和血清学ELISA检测方法，鉴于此，特制定本标准。11禽源沙门氏菌快速检测技术1 范围本标准规定了禽源沙门氏菌鉴别培养和PCR检测技术以及种鸡场主要流行沙门氏菌（B群和D群沙门氏菌属）血清学ELISA检测技术。本标准适用于各种禽类携带沙门氏菌的检疫、诊断、监测和流行病学调查，也可用于规模化种鸡场中沙门氏菌病的净化。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4789.42016食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 19495.2转基因产品检测 实验室技术要求GB/T 27401实验室质量控制规范动物检疫NY/T 5412016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3 试剂和材料3.1 除另有规定外，所用化学试剂均为分析纯。实验所用水均符合GB/T 6682二级水的规定，实验中人员配置、实验室管理、仪器设备使用、样品实验试剂和废弃物处理等均符合GB/T 27401的规定。3.2 LB液体培养基（见附录A.1）。3.3 BPW前增菌液（见附录A.2）。3.4 SC增菌液（见附录A.3）。3.5 TTB增菌液（见附录A.4）。3.6 XLD鉴别培养基（见附录A.5）。3.7 电泳缓冲液（见附录A.6）。3.8 阳性对照选择鸡白痢沙门氏菌（CVCC535）、肠炎沙门氏菌（CVCC3377）作为阳性对照。3.9 阴性对照选择不含DNA模板的灭菌超纯水。3.10 沙门氏菌（B群和D群沙门氏菌属）ELISA检测试剂盒。4 仪器设备4.1 4 普通冰箱（温控范围2 8 ）。4.2 生化培养箱（温度范围：5 50 ，温度均匀度：1 ）。4.3 二级生物安全柜。4.4 PCR仪。4.5 电泳仪（电压90 V120 V）。4.6 控温摇床（温度范围：5 50 ）。4.7 凝胶成像仪。4.8 高压灭菌锅（灭菌温度：105 135 ；工作压力：0.35 MPa）。4.9 振荡器。4.10 电子天平（感量0.001）。4.11 单道微量移液器（2 L、20 L、200 L、1 000 L）。4.12 8或12道微量移液器（10 L）与配套吸头。4.13 酶标仪。5 样品采集、储存及运输5.1 按NY/T 5412016规定进行采样。无菌操作采集疑似沙门氏菌感染禽类的粪便、脏器（匀浆）或肛拭子等，编号。5.2 样品采集和样品处理应戴一次性手套，不得交叉污染。5.3 采集的样品储存和运输，按照NY/T 5412016规定进行。6 鉴别培养和PCR检测方法本实验具体实验操作符合GB/T 19495.2转基因产品检测 实验室技术要求，样品增菌培养方案按照GB 4789.42016执行。6.1 鉴别培养6.1.1 按体积1:9比例，取粪便、脏器0.5 g或肛拭子等加入到4.5 mL的BPW前增菌液试管中，置于37 摇床中，220 rpm 培养10 h12 h。6.1.2 取培养后的前增菌液500 L分别加入到4.5 mL SC和TTB增菌液中，置于37 摇床中，220 rpm 培养18 h24 h。6.1.3 接种针蘸取培养后的SC和TTB增菌液，以“之”字形划线于XLD鉴别培养基平板，置于37 培养箱中，培养24 h48 h。6.1.4 鸡白痢沙门氏菌形成的菌落呈无色半透明状，其它沙门氏菌在XLD鉴别培养基平板上的形态一般为黑芯菌落（参见附录B）。6.1.5 每个样品挑取35个疑似菌落，分别加入500 L1 000 L LB液体培养基，37 摇床中，220 rpm 培养6 h8 h。6.2 PCR的检测方法6.2.1 引物参照参考文献（张江英等，2013），合成基于沙门氏菌fimW基因的一对引物作为沙门氏菌鉴定的通用引物，引物序列参见附录C。6.2.2 PCR扩增PCR反应总体积为25 L，引物为F1/R1，模板分别为6.1.5中培养的菌液，PCR反应体系参见附录C。PCR反应条件为94 预变性5 min，94 45 s、50 45 s、72 60 s，循环扩增35次，最后72 延伸7 min，4 保存。同时设立阴阳性对照。6.2.3 PCR产物电泳取8 L样品PCR扩增产物，进行1 %的琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，用凝胶成像仪观察结果，拍照并做好试验记录。6.3 结果判定6.3.1 试验成立条件阴性对照及空白对照PCR产物电泳后，无扩增条带；阳性对照PCR产物电泳后，在477 bp位置出现一条特异性的扩增条带，试验结果成立。否则试验不成立。（参见附录D）6.3.2 结果判定检测样品PCR产物电泳后，仅有大小约477 bp的特异性条带，则PCR结果阳性；检测样品PCR产物电泳后，无特异性条带，则PCR结果阴性。7 沙门氏菌鉴定结果根据6.3.2的结果，PCR结果阳性可判定为沙门氏菌阳性；PCR阴性则判定为沙门氏菌阴性。8 血清ELISA检测方法8.1 试剂的准备8.1.1 底物试剂：取1片底物片放入洁净容器中，加入5.5 mL的底物缓冲液，混合3 min直到完全溶解。8.1.2 洗液的配制：将一小袋洗液完全倒入1 L水中（或称取所需的用量，进行对应的稀释），使用时务必完全溶解，洗液可在4 保存1个月。8.1.3 试剂盒其它成分可以直接使用，使用前要回温至室温（22 27 ）。8.2 操作过程8.2.1 取出包被板，记录样品的位置；在A1、A2位置的两孔加入阴性对照，在A3、A4位置的两孔加入阳性对照。8.2.2 在剩余的孔内分别加入一定量的稀释好的被检样品，样品可采用双孔检测也可采用单孔检测。8.2.3 盖好反应盖板，在生化培养箱内22 27 孵育30 min。8.2.4 用300 L350 L配制好的洗液洗涤板孔，重复35次，此步骤可用洗板机也可用手洗，最后一次洗板后将液体拍干。8.2.5 每孔加入100 L酶标二抗。盖好反应板，在生化培养箱内22 27 孵育30 min。8.2.6 重复步骤8.2.4。8.2.7 每孔加入100 L底物溶液，在生化培养箱内22 27 避光孵育15 min。8.2.8 每孔加入100 L终止液。8.2.9 用酶标仪测量吸光度并且记录样品和对照的吸光度。8.3 结果判定8.3.1 试验成立的条件：按ELISA检测试剂盒质控标准进行。8.3.2 结果判定：按ELISA检测试剂盒规定进行。8.3.3 病原阴性场的血清学ELISA检测阳性率标准参见附录E。AA附录A （规范性附录）培养基配制A.1 LB液体培养液A.1.1 成分胰蛋白胨 5 g酵母提取粉 10 g氯化钠 10 g水 1 000 mLA.1.2 制备将各成分加入水中，搅混均匀，121 高压灭菌15 min。A.2 BPW前增菌液A.2.1 成分蛋白胨 10.0g氯化钠 5.0g磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O) 9.0g磷酸二氢钾 1.5g水 1 000mLA.2.2 制备将各成分加热溶解于1 000 mL水中，121 高压灭菌15 min备用。A.3 SC增菌液A.3.1 成分蛋白胨 5.0g乳糖 4.0g亚硒酸氢钠 4.0g磷酸氢二钠 10.0gL-胱氨酸 0.01g水 1 000mLA.3.2 制备将各成分加热溶解于1 000 mL蒸馏水中，无菌操作分装于灭菌三角瓶或试管中备用。当天制备当天使用，无需高压灭菌。A.4 TTB增菌液A.4.1 成分蛋白胨 9.0 g牛肉粉 4.5 g氯化钠 2.7 g碳酸钙 40.5 g胆盐 5.0 g硫代硫酸钠 50.0 g水 1 050 mLA.4.2 制备将各成分溶解于1 050 mL蒸馏水中，加热煮沸，临用前加入20 %碘液 20 mL，0.1 % 煌绿10 mL，现配现用，不宜久置。A.5 XLD鉴别培养基A.5.1 成分酵母浸粉 3.0gL-赖氨酸 5.0 g木糖 3.75 g乳糖 7.5 g蔗糖 7.5 g柠檬酸铁铵 0.8 g硫代硫酸钠 6.8 g氯化钠 5.0 g苯酚红 0.08g琼脂 13.0g水 1 000 mLpH 7.4+/- 0.2 25 A.5.2 制备将上述成分加热溶解于1 000 mL蒸馏水中，冷至50 左右时，倾入无菌平皿，备用。A.6 TAE电泳缓冲液A.6.1 成分Tris-乙酸 40 mmol/LEDTA（pH 8.0） 1 mmol/LA.6.2 制备将50倍TAE电泳浓缩缓冲液用蒸馏水50倍稀释即可。BB附录B （资料性附录）沙门氏菌在XLD培养基上菌落形态图沙门氏菌在XLD培养基上菌落形态图见图B.1。A B说明：A有黑色中心的菌落；B无色半透明菌落。图B.1 沙门氏菌在XLD培养基上菌落形态图CC附录C （资料性附录）引物序列和PCR反应体系沙门氏菌鉴定引物序列见表C.1。表C.1 沙门氏菌鉴定引物序列引物名称引物序列片段大小fimWF 5-AACAGTCACTTTGAGCATGGGTT-3477bpR 5-GAGTGACTTTGTCTGCTCTTCA-3PCR反应体系见表C.2。表C.2 PCR反应体系组分体积 (mL)水10.52Mix12.5F1 (25 mmoL/L)0.5R1(25 mmoL/L)0.5Template1 （菌液）Total25DD附录D （资料性附录）PCR检测结果电泳图PCR检测结果电泳图见图D.1。说明：M为DNA Marker DL；1-5为阳性； + 为阳性对照；- 为阴性对照。图D.1 PCR检测结果电泳图EE附录E （资料性附录）血清学阳性率标准用于病原阴性场血清学ELISA检测阳性率标准设定。依据血清学ELISA检测结果，阳性率3 %认定为沙门氏菌净化示范场判定标准，阳性率5 %认定为沙门氏菌净化创建场的血清学的判定标准。_