新城疫病毒基因VII型荧光定量PCR检测方法

ICS11.220B 41DB37山东省地方标准DB37/T XXXXXXXXX新城疫病毒基因VII型荧光定量PCR检测方法Real-time PCR assay for the detection of genotype VII newcastle disease virusXXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施山东省市场监督管理局发布DB37/T XXXXXXXXX前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学家禽研究所。本标准主要起草人：孟凯、吴家强、宋敏训、袁小远、张玉霞、杨金兴、艾武、王友令、亓丽红。5新城疫病毒基因VII型荧光定量PCR检测方法1 范围本标准规定了新城疫病毒基因VII型（NDV）荧光定量PCR检测方法。本标准适用于鸡咽喉和泄殖腔拭子及脑、肺脏、脾脏等组织中新城疫病毒基因VII型的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3 试验原理实时荧光定量PCR检测是在PCR反应体系中，除采用特异的引物外，还加入了与DNA双链非特异性结合的SYBR Green I荧光染料。当它与DNA双链结合时，发出荧光，从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。随着PCR反应的进行，每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。4 试剂或材料除非另有说明，在分析中仅使用分析纯的试剂，水为GB/T 6682规定的一级水。4.1 10磷酸盐缓冲液PBS：pH值7.2。4.2 研钵。4.3 病毒RNA提取试剂盒。4.4 SYBR Green I RT-PCR缓冲液。4.5 酶混合物：内含MLV反转录酶和RNase Inhibitor。4.6 DNA聚合酶。4.7 阳性对照：浓度为1.0105拷贝/L的阳性质粒。4.8 阴性对照：水。4.9 DEPC水。5 仪器设备5.1 微量可调移液器：最大量程为10 L、20 L、100 L、1 000 L。5.2 台式高速冷冻离心机：最高转速16 000 r/min。5.3 荧光定量PCR仪：温度范围4.0 99.9 。5.4 分析天平：精度为0.01 g。5.5 冰箱：规格为4 和-20 。5.6 二级生物安全柜。6 引物Forward Primer：5- CAYGTCYGGAGGAAGGAGRCARAA-3Reverse Primer：5-GGATGTTGRCRGCATTCTKKT-3注： Y=C或T；R=A或G；K=G或T7 样品7.1 采集工具棉拭子，剪刀，镊子，1.5 mL离心管。7.2 样品采集7.2.1 咽喉拭子/泄殖腔拭子7.2.1.1 咽喉拭子采样：将棉拭子深入喉头来回刮3次，取咽喉分泌液，放于含抗生素（青霉素2 000 U/mL+链霉素2 mg/mL）的10磷酸盐缓冲液PBS（pH值7.2）的1.5 mL离心管中。7.2.1.2 泄殖腔拭子采样：将棉拭子深入泄殖腔转一圈沾取粪便（需有可见粪便），放于含抗生素（青霉素10 000 U/mL+链霉素10 mg/mL）的PBS中。7.2.2 组织样品待检禽无菌采集脑、肺脏、脾脏等组织，装入一次性采样袋或其他灭菌容器，编号。7.3 样品运输与保存样品放于保温箱中加冰，密封，24 h内送至实验室，如不能立即检测，需将样品放于-20 冰箱保存。7.4 样品处理7.4.1 咽喉拭子/泄殖腔拭子将装有咽喉拭子/泄殖腔拭子的1.5 mL离心管在振荡器上充分混合后，取出棉拭子，4 条件下5 000 r/min离心10 min，取上清液转入新的1.5 mL离心管中，编号备用。7.4.2 组织样品将组织置于灭菌的研钵中，按照质量体积比（1:510）加入灭菌PBS进行充分研磨，4 条件下5 000 r/min离心10 min，取上清液转入新的1.5 mL离心管中，编号备用。8 试验步骤8.1 病毒RNA提取提取RNA时应避免RNA酶污染。同时设立阳性对照和阴性对照。用病毒RNA提取试剂盒，按照说明书步骤提取待检样品RNA，-80 保存备用。8.2 荧光定量PCR反应体系详见表1。表1 荧光定量PCR反应体系试剂使用量酶混合物*0.4 LDNA聚合酶0.4 L SYBR Green I RT-PCR Buffer*10 LPCR Forward Primer (10 mol/L)0.4 LPCR Reverse Primer (10 mol/L)0.4 LTotal RNA2.0 LDEPC水6.4 LTotal20 L每次均应设阴性对照。*内含MLV反转录酶和RNA酶抑制剂。*内含dNTP Mixture，Mg2+，荧光染料SYBR Green。8.3 荧光定量PCR反应程序设定详见表2。表2 荧光定量PCR反应程序设定阶段1：反转录反应阶段2：PCR反应阶段3：溶解曲线分析42 ，15 min95 ，5 sec95 ，5 sec95 ，10 sec60 ，45 sec（收集荧光）65 ，5 sec1 Cycle40 Cycle95 ，5 sec9 结果判定9.1 结果分析条件设定阈值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点为准。9.2 试验成立条件9.2.1 阴性对照无Ct（或Cp）值并且无扩增曲线。（参见附录A.1）9.2.2 阳性对照Ct（或Cp）值35，并出现特定扩增曲线。（参见附录A.2）9.2.3 如阴性和阳性对照不满足以上条件，此试验视为无效。9.3 结果描述及判定9.3.1 阴性无Ct（或Cp）值并且无扩增曲线，表明样品中无基因VII型新城疫病毒核酸。9.3.2 阳性Ct（或Cp）值35，且出现特定扩增曲线，Tm值为83.5 ，表明样品中存在基因VII型新城疫病毒核酸。（参见附录A.3）9.3.3 有效原则Ct（或Cp）值35的样品须复检，重做结果无Ct值者为阴性，否则为阳性。AA附录A （资料性附录）荧光定量标准曲线参考图阴性曲线图见图A.1。图A.1 阴性曲线图阳性曲线图见图A.2。图A.2 阳性曲线图溶解曲线图见图A.3。图A.3 溶解曲线图_