绵羊和山羊源性成分同步检测方法 实时荧光PCR法 编制说明

编制说明项目名称： 绵羊和山羊源性成分同步检测方法 实时荧光PCR法项目编号： 内质监标函2018307号 编制单位： 锡林郭勒职业学院 一、工作简况本项目来源于2018年第3批内蒙古自治区地方标准制修订项目（内质监标函2018307号）。起草单位为锡林郭勒职业学院，协作单位为锡林郭勒食品检验检测和风险评估中心。主要起草人：郭梁、刘国强、于园、徐伟良、罗建兴、李春冬。二、制定标准的必要性和意义来源于绵羊和山羊的肉制品深受消费者的喜爱，是农畜产品市场中重要组成部分。市场中存在用低价肉冒充绵羊和山羊肉等高价肉的欺诈违法行为，亟需制定针对肉乳制品的绵羊和山羊源性成分同步检测方法。目前，已经存在六项羊源性检测方法标准：饲料中牛羊源性成分的定性检测 定性聚合酶链式反应（PCR）法（GB/T 20190-2006）；明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法 实时荧光PCR法（GB/T 25165-2010）；动物源性饲料中反刍动物源性成分(牛,羊,鹿)定性检测方法 PCR方法（GB/T 21104-2007）；饲料中牛羊源性成分检测 实时荧光聚合酶链反应法（NY/T 1946-2010）；食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法 实时PCR法（SN/T 2051-2008）；动物产品中牛、山羊和绵羊源性成分三重实时荧光PCR检测方法（SN/T 2980-2011）。在采用上述检测标准后发现：目前缺乏基于多重实时荧光PCR法、同管质量控制体系、针对肉乳制品的绵羊和山羊源性成分同步检测方法的相关标准。本标准是基于多重实时荧光PCR法、同管质量控制体系、针对肉乳制品的绵羊和山羊源性成分同步检测方法的相关标准，具有快速、高通量以及去除假阴性等特征。三、主要起草过程本标准制定工作从2018年10月开始，组织成立了标准起草团队。起草团队首先进行相关标准、专利以及论文的收集和整理工作，制定了基于多重实时荧光PCR法、同管质量控制体系、针对肉乳制品的动物源性成分检测标准体系的研发目标，计划形成绵羊（Ovis aries）、山羊（Capra hircus）、马（Equus caballus）、黄牛（Bos taurus）、水牛（Bubalus bubalis）、牦牛（Bos grunniens）、猪（Sus scrofa）、驴（Equus asinus）、双峰驼（Camelus bactrianus）、梅花鹿（Cervus nippon）、鸡（Gallus gallus）、鸭（Anas platyrhynchos）及鹅（Anser anser）等13个物种、针对肉（鲜肉、肉干及香肠）和乳（鲜乳、发酵乳、乳酪及乳粉）的常见动物源性成分检测标准体系。具体实验过程如下：（一） 在NCBI中下载不同物种（绵羊、山羊、马、牛、水牛、牦牛、猪、驴、双峰驼、梅花鹿、鸡、鸭及鹅等13个物种）的线粒体序列。为了保证引物和探针的物种适用性，每个物种下载5-20个品种或品系的线粒体序列；利用生物信息学软件（Clustal X或MAGE 5）对所下载的线粒体序列进行比对。筛选物种间特异品种间保守的序列为目标靶向区域（5-10个），针对目标靶向区域设计5组引物和探针组合。上游引物的3端距离探针的5端为1-20 bp，探针的5端避免出现G，探针Tm要高于引物Tm值10左右；不同物种的探针用不同的荧光基团标记（FAM、HEX、ROX以及CY5）；如果探针Tm值和引物Tm值接近，探针3端可以选择MGB基团；（二） 收集各种来源于不同动物的肉（鲜肉、肉干及香肠）。利用改良CTAB法提取样品的DNA（A260 nm/A280 nm1.8，琼脂糖凝胶电泳主带无拖尾，Nanodrop和Qubit定量一致性较高）；（三） 特异性分析：利用实时荧光PCR对5组引物和探针进行检测，有典型扩增曲线且Ct值35计为检出。在阳性对照检出、阴性对照未检出、对5组引物和探针进行特异性的分析评价。反应体系（20 L）：TransStart Probe qPCR SuperMix 10 L（北京全式金生物技术有限公司），引物各1 L，探针各0.5 L，模板DNA 1 L，补水至20 L。反应条件：94、30 s，1个循环；94、5 s，60、31 s，40个循环；（四） 绝对灵敏度分析：以来源于不同肉乳制品的高质量DNA为模板母液，用灭菌ddH2O稀释模板母液，共稀释10个梯度，稀释后质量浓度分别为100、10、1、0.1、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00001 ng/L。以不同稀释浓度的DNA为模板对5组引物和探针进行检测，根据PCR反应的Ct值分析此方法对于不同浓度模板DNA的检测灵敏度。检出限（LOD）统计分析参照Probit analysis。比较5组引物和探针的绝对灵敏度，分析引物和探针的特异性和保守性与绝对灵敏度之间的相关性；（五） 掺假检出限（相对灵敏度）分析：首先，制备模拟掺假混合样品（0.1%、1%、10%、30%、70%、90%、99%、99.9%），以上述掺假组为模板对5组引物和探针进行检测，根据PCR反应的Ct值分析此方法对于不同浓度掺假的掺假检出限。检出限（LOD）统计分析参照Probit analysis。比较5组引物和探针的掺假检出限（相对灵敏度），分析引物和探针的特异性和保守性与掺假检出限之间的相关性；（六） 定量分析：以模板质量浓度和掺假浓度的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标，构建绝对定量标准曲线和掺假定量标准曲线，分析引物和探针的特异性和保守性与扩增效率和相关系数的相关性；利用已知浓度的盲样验证定量标准曲线的适用性，通过扩增效率（90%-110%）、相关系数R2（0.99）以及回收率（90%-110%）评价5组引物和探针的定量分析能力，分析引物和探针的特异性和保守性与定量分析能力之间的关系；（七） 相关数据已经进行论文投稿以及专利申请。目前发表SCI论文2篇，在投稿SCI论文3篇，中文核心论文8篇，申请国家发明专利8项（授权1项）。最终通过上述实验确定绵羊和山羊源性成分同步检测的引物和探针以及绝对灵敏度（1 pg）和相对灵敏度（0.1-1%）。此方法具有绵羊和山羊源性的特异性，来源于绵羊和山羊的肉乳样品均出现相应探针的典型扩增曲线，且特异性探针Ct值35.0，质控探针Ct值35.0；来源于非绵羊和山羊的肉乳样品均没有出现相应探针的典型扩增曲线，或特异性探针Ct值40.0，质控探针Ct值35.0。结合实验室验证试验所获得的数据，起草了标准讨论稿，现面向专家征求意见。四、制定标准的原则和依据，与现行法律、法规、标准的关系（一）总体原则1.合法性。严格遵循食品安全法等法律法规的有关规定。2.科学性。按照有关食品安全国家标准和在开展指标验证的基础上，科学、合理制定该地方标准。3.真实性。坚持公开透明，从标准立项、专家论证、征求意见等方面向社会公开征求意见和建议。（二）编制原则：坚持先进性、实用性、可操作性、规范性、公开透明的原则。五、主要条款的说明，主要技术指标、参数、试验验证的论述本标准是基于多重实时荧光PCR法、同管质量控制体系、针对肉乳制品的绵羊和山羊源性成分同步检测方法。方法具有特异性，绝对灵敏度和相对灵敏度可以达到1 pg和0.1-1%。此方法具有绵羊和山羊源性的特异性，来源于绵羊和山羊的肉乳样品均出现相应探针的典型扩增曲线，且特异性探针Ct值35.0，质控探针Ct值35.0；来源于非绵羊和山羊的肉乳样品均没有出现相应探针的典型扩增曲线，或特异性探针Ct值40.0，质控探针Ct值35.0。试验验证过程参考上述具体实验过程以及相关发表论文材料与方法。经过特异性分析、绝对灵敏度分析、掺假检出限以及定量分析，检出限（LOD）统计分析参照Probit analysis，此方法的各项参数指标（特异性、灵敏度、检出限）均达到编制标准的要求。六、 重大意见分歧的处理依据和结果无七、采用国际标准或国外先进标准的，说明采标程度，以及国内外同类标准水平的对比情况目前，已经存在六项羊源性检测方法标准：饲料中牛羊源性成分的定性检测 定性聚合酶链式反应（PCR）法（GB/T 20190-2006）；明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法 实时荧光PCR法（GB/T 25165-2010）；动物源性饲料中反刍动物源性成分(牛,羊,鹿)定性检测方法 PCR方法（GB/T 21104-2007）；饲料中牛羊源性成分检测 实时荧光聚合酶链反应法（NY/T 1946-2010）；食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法 实时PCR法（SN/T 2051-2008）；动物产品中牛、山羊和绵羊源性成分三重实时荧光PCR检测方法（SN/T 2980-2011）。在采用上述检测标准后发现：目前缺乏基于多重实时荧光PCR法、同管质量控制体系、针对肉制品的绵羊和山羊源性成分同步检测方法的相关标准。本标准是基于多重实时荧光PCR法、同管质量控制体系、针对肉乳制品的绵羊和山羊源性成分同步检测方法的相关标准，具有快速、高通量以及去除假阴性等特征。八、其他应说明的事项无九、标准草稿征求意见情况汇总表序号意见提出单位/专家采纳不采纳（说明原因）11. 原理要针对本标准的检测方法，具体的研发过程在编制说明中体现；2. 所用试剂应该体现配制方法，体现可操作性和可重复性；3. PCR混合液要写出配方；4. 兼并引物要用相应字母代替；5. 目的基因（线粒体12S rRNA）的写法有待商榷；6. 仪器不能写在一大段中，每个仪器设备是一段；7. DNA提取实验步骤要具体，比如样品的起始质量；8. 每个PCR扩增反应需要两个平行；9. 反应程序不完整，修改格式以及增加收集荧光部分；10. 缺乏PCR扩增序列信息；11. 质量控制中内容应该修正为无荧光对数增长或Ct值40.0。农业部农产品质量安全监督检验测试中心（呼和浩特）/任超采纳21. 试样制备，可添加试样制备时的取样方法：如固体样品的取样点数、总样品的四分法，保证样品的均一性与代表性；每份样品应制备2个测试样本提取DNA，即设立双平行；2. 各引物、探针可注明序列长度；扩增后的目的片段也可注明序列长度；3. 扩增体系表中可注明模板的浓度；4. CTAB法提取基因组，是否需要蛋白酶K，使得降解更加快速彻底；5. 可增加附录，使得使用者更方便配制各类溶液；6. CTAB提取液中各成分标示应统一单位；7. 5.1.3中，可标明各成分使用量，方便使用者可选择自行配制或购买预成品试剂。内蒙古自治区食品检验检测中心/张彦斌 采纳31. 标准中“4原理”部分：凝练对所制定标准物种源性的原理描述，其中“定性分析”描述不准确；2.标准中“5.1试剂与材料”部分：应添加“除特别说明外，试剂配制所用溶剂都为重蒸馏水”；3.标准中“5.1.1、5.1.2”部分：所用试剂部分应分开列明信息；4. 标准中“5.1.3”部分：“实时荧光PCR反应混合液购买于具有资质的试剂公司”宜改为“市售实时荧光PCR反应混合液”5. 标准中“5.2仪器设备”部分：标注微量移液器与pH计的精度；6. 标准中“5.3.1试样制备”部分：试样制备中“明显脂肪”、“复原乳”“固状”等词用法有待商榷；7. 标准中“5.3.2 DNA提取”部分：实验具体操作步骤描述不符合标准制定要求，例如“消化”、“75%乙醇洗涤一次，晾干”、“上清与上清液”、“中间层”等；8. 标准中“5.3.4.1 表2”部分：表2中体积“L”可统一标注于“体积（L）”；9. 编制说明中应添加实验数据，阐明所设计方法的有效性和可靠性。内蒙古农业大学/田瑞华采纳