DBS13004—2016 创伤弧菌检验

附件 12016- -发 布 2016- - 实施 北省地方 标 准 04 2016 食品安全地方标准 创伤弧菌检验 （征求意见稿） 河北省卫生和计划生育委员会 发布 04 2016 1 前 言 本标准附录 本标准由河北省卫生和计划生育委员会归口。 本标准于 2016年月日首次发布。04 2016 1 食品安全地方标准 创伤弧菌检验 1 范围 本标准规定了水产品中创伤弧菌（ 检验方法。 本标准适用于水产品中创伤弧菌的检验。 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 温培养箱： 36 1 、 ； 箱： 2 5 、 7 10 ； 温水浴箱： 45 1 ； 质器或无菌乳钵； 平：感量 0.1 g； 菌试管： 18 80 15 00 菌吸管： 1 10 0.1 微量移液器及吸头； 菌锥形瓶：容量 250 500 1000 菌培养皿：直径 90 菌手术剪、镊子等； 自动微生物生化鉴定系统。 3 培养基和试剂 氯化钠碱性蛋白胨水：见附录 良纤维二糖 （ 脂：见附录 维二糖 （ 脂：见附录 氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂：见附录 氯化钠三糖铁琼脂：见附录 盐性试验培养基：见附录 氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录 氯化钠 养基：见附录 04 2016 2 氯化钠溶液：见附录 化酶试剂：见附录 兰氏染色液：见附录 硝基酚 剂：见附录 剂：见附录 化鉴定试剂盒。 4 检验程序 创伤弧菌检验程序见图。 图 1 创伤弧菌检验程序 5 操作步骤 品制备 非冷冻样品采集后应立即置 7 10 冰箱保存，尽可能及早检验 ；冷冻样品应在 45 以下不超过 15 5 不超过 18 生化试验或选用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统 筛选试验 氧化酶试验，革兰氏染色， 3%氯化钠三糖铁琼脂，嗜盐性试验 板 样品 25 g（ +225 % 氯化钠碱性蛋白胨水 挑取可疑菌落，接种于 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂 结果报告 36 1 ， 18 h 24 h 39 40 ， 18 h 24 h 36 1 ， 18 h 24 h 04 2016 3 鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃。贝类取全部内容物，包括贝肉和体液 。 甲壳类取整个动物，或者动物的中心部分，包括肠和鳃。如为带壳贝类或甲壳类，则应先在自来水中洗刷外壳并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，按上述要求取相应部分。 以无菌操作取样品 25 g（ 加入 3氯化钠碱性蛋白胨水 225 旋转刀片式均质器以 8 000 r/10 000 r/ 2 或拍击式均质器拍击 1 2 备成 1:10的样品匀液。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵，自 225 氯化钠碱性蛋白胨水中取少量稀释液加入无菌乳钵，样品磨碎后放入 500 菌锥形瓶，再用少量稀释液冲洗乳钵中的残留样品 1 2次，洗液放入锥形瓶，最后将剩余稀释液全部放入锥形瓶，充分振荡，制备 1:10的样品匀液。 菌 将上述 1:10样品匀液于 36 1 培养 18 h 24 h。 离 对所有显示生长的增菌液，用接种环在距离液面以下 1 沾取一环增 菌液，于 39 40 培养 18 h 24 h。 典型的创伤弧菌在 、扁平、中心不透明边缘透明的黄色菌落，直径 1 2 培养 挑取 3个或以上可疑菌落，划线接种 3氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板， 36 1 培养 18 h24 h。 步鉴定 化酶试验：挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，创伤弧菌为氧化酶阳性。 片镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。创伤弧菌为 革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞，有鞭毛。 取纯培养的单个可疑菌落，转种 3%氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层， 36 1 培养 24 伤弧菌在 3%氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色变黄。 盐性试验：挑取纯培养的单个可疑菌落，分别接种 0%、 3%、 6%、 8%和 10%不同氯化钠浓度的胰胨水， 36 1 培养 24 h，观察液体混浊情况。创伤弧菌在无氯化钠、 8氯化钠和 10%氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长，在 3%、 6%氯化钠的胰 胨水中生长旺盛。 确证鉴定 取纯培养物分别接种含 3%氯化钠的赖氨酸脱羧酶试验培养基、 养基， 36 1 培养24 h 48 h 后观察结果； 3%氯化钠三糖铁琼脂隔夜培养物进行 验。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定 系统 。创伤弧菌的生化性状见表 1，创伤弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别见表 2。 6 报告 综合以上生化试验的结果，报告 25 g（ 品中检出或未检出创伤弧菌。 04 2016 4 表 1 创伤弧菌的生化性状 试验项目 结果 革兰氏染色镜检 阴性，棒状或弧状 氧化酶 动力 蔗糖 葡萄糖 分解葡萄糖产气 乳糖 硫化氢 赖氨酸脱羧酶 注： 表示 阳性； 表示 阴性。 04 2016 5 表 2 创伤弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别 名称 氧 化 酶 赖 氨 酸 精 氨 酸 鸟 氨 酸 明 胶 脲 酶 2 生长 蔗 糖 D 纤维 二糖 乳 糖 阿拉 伯糖 D 甘 露 糖 D 甘 露 醇 0g O/129 150g O/129 嗜盐性试验 量（ %） 0 3 6 8 10 创伤弧菌 + - + + - - + - + + - + V + S S - + + - - 副溶血性弧菌 + - + + V - + - V - + + + - R S - + + + - 溶藻弧菌 + - + + - + + + - - - + + - R S - + + + + 霍乱弧菌 + - + + - V + + - - - + + + S S + + - - - 拟态弧菌 + - + + - - + - - - - + + + S S + + - - - 河弧菌 - + - + - - V + + - + + + + R S - + + V - 弗氏弧菌 - + - + - - - + - - + + + + R S - + + + - 梅氏弧菌 + + - + - + V + - - - + + + S S - + + V - 霍利斯弧菌 - - - - - - - - + + - - nd + + - - 嗜水气单胞菌 V + - + - V V + V V V + + + R R + + + - - 类志贺邻单胞菌 + + + - - - + - - - - - - - S S + + - - - 注 ： 表示 阳性； 表示 阴性 ； R 表示耐药； S 表示敏感； 示未试验； V 表示可变。 04 2016 6 附录 A 培养基和试剂 氯化钠碱性蛋白胨水 分 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 30.0 g 蒸馏水 法 将成分 (于蒸馏水中 ,调节 121 高压灭菌 10 良纤维二糖 （ 脂 液 1 分 蛋白胨 肉粉 化钠 麝香草酚蓝 酚红 脂 馏水 法 将成分（ 于蒸馏水中，调节 热煮沸至完全溶解。冷至 48 55 备用。 液 2 成分 纤维二糖 粘菌素 B 100000U 多粘菌素 E 400000U 蒸馏水 法 纤维二糖溶于蒸馏水中，轻微加热至完全溶解，冷 却后加入抗菌素，过滤除菌。将溶液2与溶液 1混合，倾注平板备用。 维二糖 （ 脂 液 1 04 2016 7 分 蛋白胨 肉粉 化钠 麝香草酚蓝 酚红 脂 馏水 法 将成分（ 于蒸馏水中，调节 热煮沸至完全溶解。冷至 48 55 备用。 液 2 分 纤维二糖 粘菌素 E 400000U 蒸馏水 法 纤维二糖溶于蒸馏水中，轻微加热至完全溶解，冷却后加入抗菌素，过滤除菌。将溶液2与溶液 1混合，倾注平板备用。 氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂 分 胰蛋白胨 豆蛋白胨 化钠 脂 馏水 法 将成分（ 于蒸馏水中，调节 121 高压 灭菌 15 氯化钠三糖铁琼脂 04 2016 8 分 蛋白胨 示蛋白胨 肉粉 母粉 化钠 糖 糖 萄糖 酸亚铁（ 红 代硫酸钠 脂 馏水 法 将成分（ 于蒸馏水 中，调节 装到适当容量的试管中。 121 高压灭菌15 成高层斜面，斜面长 45层深度 23 盐性试验培养基 分 胰蛋白胨 化钠 按不同量加入 蒸馏水 法 将成分（ 于蒸馏水中，调节 配制 5瓶，每瓶 100 瓶分别加入不同量的氯化钠：（ 1）不加 ;（ 2） 3g; （ 3） 6g;（ 4） 8g;（ 5） 10g。分装试管， 121 高压灭菌 15 氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基 分 蛋白胨 母粉 萄糖 甲酚紫 化钠 馏水 04 2016 9 法 除赖氨酸以外的成分（ 于蒸馏水中，调节 按 比例加入赖氨酸，对照培养基不加赖氨酸。分装小试管，每管 0.5 121 高压灭菌 15 验方法 从琼脂斜面上挑取培养物接种，于 36 1 培养不少于 24 h，观察结果。赖氨酸脱羧酶阳性者由于产碱中和葡萄糖产酸，故培养基仍应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡糖糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。 氯化钠 养基 分 多价蛋白胨 萄糖 酸氢二钾（ 化钠 馏水 法 将成分（ 于蒸馏水中，调节 装试管， 121 高压灭菌 15 氯化钠溶液 分 氯化钠 馏水 法 将氯化钠溶于蒸馏水中， 121 高压灭菌 15 化酶试剂 分 N,N,N,N,馏水 制法 少量新鲜配制，于 2 5 冰箱内避光保存，在 7 验方法 用细玻璃棒或一次性接种针挑取新鲜（ 24 h）菌落，涂布在氧化酶试 剂湿润的滤纸平板上。如果滤纸在 10 为氧化酶试验阳性。不变色为氧化酶试验阴性。 04 2016 10 兰氏染色液 晶紫染色液 分 结晶紫 5乙醇 草酸铵水溶液 法 将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 兰氏碘液 分 碘 化钾 馏水 法 将碘与碘化钾先进行混合， 加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300 黄复染液 分 沙黄 5%乙醇 馏水 法 将沙黄溶于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。 染色法 加结晶紫染色液，染 1 洗。 用 1 洗。 5%乙醇脱色，约 15 s 30 s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。 染 1 洗、待干、镜检。 硝基酚 剂 冲液 04 2016 11 分 磷酸二氢钠（ 蒸馏水加至 法 将磷酸二氢钠溶于蒸馏水中，调节 至 缓冲液置 2 5 冰箱保存。 液 分 邻硝基酚 馏水 冲液 法 将 6 1 的蒸馏水中溶解，加入缓冲液。 5 冰箱保存，试验前，将所需用量的 6 1 。 验方法 将待检培养物接种 3%氯化钠三糖铁琼脂， 36 1 培养 18 h。挑取 1满环新鲜培养物接种于 %氯化钠溶液，在通风橱中，滴加 1滴甲苯，摇匀后置 36 1 水浴5 液， 36 1 培养观察 24 h。阳性结果呈黄色。阴性结果则24 剂 成分 甲液 水乙醇 液 氢氧化钾 蒸馏水加至 试验方法 将 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂生长物接种 3%氯化钠 36 1培养 48 h。取 1放到一个试管内，加 0.6 动。加 动。加入 3 4 性结果呈现伊红的粉红色。 04 2016 12 食品安全地方标准 创伤弧菌检验（ 01 编制说明 一、 任务来源与编号、参与协作单位、简要起草过程、主要起草人及其所承担的工作等 1. 任务来源 本标准对食品安全地方标准 创伤弧菌检验进行制定。该项目为河北省卫计委项目，受河北省卫计委地方标准专业委员会委托。项目编号：01 2. 承担及参加单位 本标准负责起草单位：河北省疾病预防控制中心。 本标准主要参加单位：秦皇岛市疾病预防控制中心、唐山市疾病预防控制中心。 3. 主要起草人：申志新、关文英、侯凤 伶、韩艳青、张淑红、刘兰吉、时晨、王建红、卢俊荣。 4. 标准制定的主要过程： （ 1）收集国内外标准与文献：标准起草负责人组织起草人员收集国内外创伤弧菌检测方法和相关文献共 30余篇。 （ 2）召开河北省食品安全地方标准专家论证会：省卫计委于 2015年 6月 23织部分省内食品安全专家委员会委员对本项目建议书进行了论证和研讨。与会专家认为本项目建议书思路清晰严谨，科学合理，计划周密，经费预算合理，具有可操作性，并按专家意见对方案进行了修改，经审查合格，同意立项实施。 （ 3）制定检测方法：在参阅国内外标准和文献 基础上，确定方法制定原则、主要检测过程和方法验证，草拟实施方案。 （ 4）实验条件的选择和优化： A、增菌液的选择和优化：选择 004 “ 和 2007S 21872 2部分除副溶血弧菌和霍乱弧菌以外菌种的检测 两项国际标准和 04 2016 13 食品安全国家标准 食品微生物检验 副溶血性弧菌检验和公开发表文献中使用的 种增菌液，进行 8h、 18h、 24果表明 种增菌液增菌效果无统计学显著差异，增菌时间 8h、 18h、24此，本标准选择既经济又普遍使用的 3%氯化钠碱性蛋白胨水（ 为增菌液，增菌时间在 18h 24h。 B 、 分 离 培 养 基 的 选 择 和 优 化 ： 选 择 004 “ 和 2007S 21872 2 部分除副溶血弧菌和霍乱弧菌以外菌种的检测 两项国际标准和 品安全国家标准 食品微生物检验 副溶血性弧菌检验及公开发表文献中使用的 m 弧菌显色、 果表明，五种培养基对创伤弧菌的选择效率从高到低为 m 弧菌显色 此，本标准采用 m （ 5）样品检测： 2015 年 6月 疾控中心和秦皇岛市疾控中心、唐山市和沧州市疾控中心工 作人员对北戴河区及沧州市市售海产品进行了创伤弧菌检测，共采集鱼类、甲壳类和贝类 202 份，检出 11 株创伤弧菌，检出率为 为我省首次检出。 6）标准验证：根据项目制定方案，沧州市疾控中心和邯郸市疾控中心对本方法进行了验证试验，并出具正式的验证报告。 (7)起草标准文本：参照国际标准、国家标准和实验室验证试验情况 撰写食品安全地方标准 创伤弧菌检验标准文本的征求意见稿和标准编制说明等材料。 (8)召开研讨会 : 2015 年 10 月 27 日 在北戴河河北省气功疗养院召开了河北省地方标准专家 论证会，会上邀请了省卫计委综合监督执法局、河北农业大学、河北科技大学、衡水学院生命科学学院、国家葡萄、葡萄酒质量监督检验中心和5个市级疾控中心的 15位专家，对本标准进行了全面审核 ,对需要进一步修改、确认和完善之处提出了建议。 （ 9）提交食品安全地方标准 创伤弧菌检验（送审稿）及编制说明、征求意见汇总表供标委会审议。 （ 10）专家审核：省卫计委组织我省食品安全委员会有关专家对标准征求意见稿04 2016 14 进行审核，提出修改意见，标准起草人修改后形成标准报审稿。公开向社会征求意见。 （ 11）标准报批：标准起草人 对修改意见进行整理，进一步完善标准，形成标准报批稿。报省卫计委批准、发布、实施。 二、 本标准立项背景 创伤弧菌（ 也称海洋弧菌，属于 弧菌属 ，是一种革兰氏阴性嗜盐菌，栖息于河口和海洋环境中。能够引起胃肠炎、伤口感染和原发性败血症，发病急，病情发展很快，创伤弧菌为全球重要的海洋致病细菌，与 霍乱弧菌、副溶血弧菌并列为造成人类感染疾病的三大弧菌。人类感染创伤弧菌主要是食用生的或半生的受到污染的海产品，或者是伤口接触了带菌的海水或海产品。 在美国，创伤弧菌是海产品消费中引起死亡的首要病因，日本每年创伤弧菌败血症病例数约为 425例。我国沿海地区也时有创伤弧菌散发病例的报告。 于在进口检验中，从泰国产速冻馄饨和饺子中检测出创伤弧菌污染，韩国食品药品管理局（ 2010年 5月 13日对泰国含虾馄饨实施禁令并拒绝入境。 人食用被上述病原体污染的海鲜产品（如牡蛎、蛤和螃蟹等）后，或开放伤口接触此物污染的海水后，会受到感染。如果是经食物感染的，健康的成年人会犯肠胃炎，而身体虚弱者则可能导致原发性败血症或死亡。 我国于 2012 年将创伤弧菌列入国家食品安全风险监测计划中，对水产品中创伤弧菌进行全国范围的风险监测。 目前，我国没有创伤弧菌标准检验方法，给我省开展创伤弧菌风险监测造成方法不统一、监测质量没有保障、监测结果不能比对等诸多困难。因此，制定我省创伤弧菌标准检验方法具有重要 的现实意义和社会效益。 三、 国内和国际标准情况 1、目前没有国家强制性创伤弧菌检测标准方法。 2、我国现行 2 个行业推荐标准： 1870 食品中致病菌检测方法 出口食品中致病菌环介导恒温扩增（ 测方法 第 13部分：创伤弧04 2016 15 菌（ 上述 2个方法均属分子生物学初筛方法，无法获得创伤弧菌菌株。 本标准拟采用创伤弧菌检验经典方法 上述方法没有关系。 3、本标准参照 004 “ 、“ 2007S 21872 2 部分除副溶血弧菌和霍乱弧菌以外菌种的检测” 和国内外杂志公开报道的创伤弧菌检验方法的文献 制定。 四、 标准的主要内容及制定情况 1. 样品制备 参照 食品微生物检验 副溶血性弧菌检验 冷冻样品采集后应立即置 7 10 冰箱保存，尽可能及早检验；冷冻样品应在 45 以下不超过 15 5 不 超过 18 类和头足类动物取表面组织、肠或鳃。贝类取全部内容物，包括贝肉和体液 。 甲壳类取整个动物，或者动物的中心部分，包括肠和鳃。如为带壳贝类或甲壳类，则应先在自来水中洗刷外壳并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，按上述要求取相应部分。 无菌操作取样品 25 g（ 加入 3氯化钠碱性蛋白胨水 225 旋转刀片式均质器以 8 000 r/10 000 r/质 1 2 拍击式均质器拍击 1 2 备成 1:10 的样品匀液。如无均质 器，则将样品放入无菌乳钵，自 225 氯化钠碱性蛋白胨水中取少量稀释液加入无菌乳钵，样品磨碎后放入 500 菌锥形瓶，再用少量稀释液冲洗乳钵中的残留样品 1 2 次，洗液放入锥形瓶，最后将剩余稀释液全部放入锥形瓶，充分振荡，制备 1:10的样品匀液。 2. 增菌 增 菌 液 的 选 择 和 优 化 ： 选 择 004 “ 和 2007S 21872 2 部分除 副溶血弧菌和霍乱弧菌以外菌种的检测 两项国际标准和 品安全国家标准 食品微生物检验 副溶血性弧菌检验04 2016 16 和公开发表文献中使用的 较 8h、 18h、 24试验 菌时间 8h、18h、 24h 两两比较无差异，因此选择既经济又普遍使用的 3%氯化钠碱性蛋白胨水（ 为增菌液，增菌时间在 18h 24h。 3. 分离 分离培养基的选择和优化： 004 “ 和 2007S 21872 2部分除副溶血弧菌和霍乱弧菌以外菌种的检测 两项国际标准和 食品微生物检验 副溶血性弧菌检验及文献中使用的 m 弧菌显色、 种分离培养基，经试验，五种培养基对创伤弧菌的选择效率从高到低为 m 弧菌显色 标准采用 m 4. 鉴定方法 初步鉴定和确证鉴定所选择的生化性状和创伤弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别（表 1 创伤弧菌的生化性状、表 2 创伤弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别）分别参照了 004 、 2007S 21872 2部分除副溶血弧菌和霍乱弧菌以外菌种的检测。 5. 商品化鉴定系统的应用 本标准应用了 全自动微生物生化鉴定系统 和 生化鉴定试剂盒 。这些方法都比较成熟，稳定性较好，已被许多国家和组织的标准采用，鉴定效果很好。 6. 结果与报告 参照 品安全国家标准 食品微生物检验 副溶血性弧菌检验定性检测报告。 五、 主要进行的实验室验证试验 1、三种增菌液不同增菌时间分离效果比较 （ 1）试验菌悬液的制备： 创伤弧菌 自中国菌种保藏管理中心 、创伤弧菌 伤弧菌 伤弧菌 10伤弧菌10 04 2016 17 将创 伤弧菌 5株分离株分别接种于 3%氯化钠 ( 36 1) 培养 24h 后，挑取菌落悬浮于 3%无菌盐水中，制备 麦氏单位， 10倍稀释成系列菌悬液，并分别计数，得出实际接种菌量，选择含活菌数约为 100 200 稀释度用于不同增菌时间的测试。 （ 2）吸取 1悬液分别接种于 10接种后8h、 18h、 24 h 分别吸取 种增菌培养物做 10 倍递增稀释后，取适当稀释度做平板菌落计数，比较菌株在三种增 菌液中的增菌效果。 （ 3）菌落计数方法：取 1递增稀释后增菌液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿，及时倾注 20 6的 3%氯化钠 匀，凝固后翻转平板 37培养 24h。 （ 4）结果： 表 1 创伤弧菌标准株及分离菌株在三种增菌液中生长状况 菌 株 实际接种菌量（ 8h 18h 24h 8h 18h 24h 8h 18h 24h 标准菌株(02 105 107 107 105 109 08 05 010 109 分离株 （ 02 106 108 108 108 108 07 07 08 107 分离株 （ 02 108 107 108 108 108 07 08 08 108 分离株 （ 10 02 106 108 108 105 108 08 06 09 108 分离株 04 2016 18 （ 10 102 104 106 108 104 108 108 103 107 109 分离株 （ 02 108 108 108 109 107 07 09 07 107 (5)使用统计软件 1= 2= 3= h 8h 4h s s W 158 543 500 上表是球形假设检验的结果，这是重复测量方差分析重要结果之一。球形检验的无效假设 重复测量数据之间不存在相关性； 重复测量数据之间存在相关性。此处检验水准为保守起见一般设为 例中计算 P=绝 受 认为重复测量数据之间存在相关性。满足重复测量方差分析的条件。 um 252 04 2016 19 1 250 252 248 601 601 601 601 0 上表即是重复测量方差分析的最主要结果之一，第一行 面三行 F=P=明同种增菌液在不同时间点观察的创伤弧菌活菌数的不存在统计学差异。 um 032 310 5 该表即三种创伤弧菌增菌液比较的方差分析结果， F=P=明三组之间差异不明显，无统计学意义。 表 2 创伤弧菌标准株及分离菌株在三种增菌液中不同时间生长状况比较 增菌液 菌液 8h 8h 18h 8h 8h 18h 8h 8h 18h 18h 24h 24h 18h 24h 24h 18h 24h 24h p 04 2016 20 (6)实验结果表明， 菌时间8h、 18h、 24h 两两比较无差异，因此选择既经济又普遍使用的 3%氯化钠碱性蛋白胨水（ 为增菌液，增菌时间在 18h 24h。 2、 五种分离培养基试验菌株的生长性能测试 （ 1） 试验菌悬液的制备：将创伤弧菌 5株分离株分别接种于 N ( 36 1) 培养 24h 后，挑取菌苔悬浮于无菌生理盐水中，制备 109)， 10倍稀释成不同剂量的系列菌悬液，取 100于生长性能测试。 (2)试验菌悬液的接种各取上述菌悬液 0 1 弧菌显色和 N 板于 培养 18 h 24 h。 N 板于 ( 36 1) 培养 18 h 24 h 后进行菌落计数。计数 N 0 2 103 (3)结果 ： 表 3 五种分离培养基生长性能测试结果 菌株编号 分离阳性数 稀释度 菌显色 盐 06 227 812 0 0 0 920 105 140 87 0 0 0 160 104 2 3 0 0 0 58 103 0 3 0 0 0 30 06 360 440 240 103 400 633 105 200 98 24 17 102 140 104 23 16 0 1 13 8 103 0 2 0 1 0 1 06 900 900 378 178 510 1200 105 73 300 181 24 126 148 04 2016 21 104 30 45 3 1 20 17 103 0 1 1 0 0 0 1006 45 104 5 0 0 1104 105 1 18 0 0 0 200 104 0 1 0 0 0 11 103 0 0 0 0 0 1 1006 30 142 0 0 612 800 105 0 24 0 0 35 192 104 0 1 0 0 0 6 103 0 0 0 0 0 1 06 179 241 81 0 300 2520 105 6 14 6 14 7 91 104 0 5 0 0 1 17 103 0 0 0 0 0 5 （ 4）数据分析方法 : 采用 19 0 软件 对不同稀释度的 6株创伤弧菌在五种培养基上生长的阳性数进行统计，稀释度为 106 株创伤弧菌在 C 培养基均检出，在 弧菌显色培养基上检出 4 株，在 养基上检 2 株。随着稀释浓度越来越低，创伤弧菌在各个培养基上的阳性检出均有下降，稀释度为 10菌液，创伤弧菌在 株， 株，在 表 4： 表 4 不同稀释度的创伤弧菌在五种培养基上生长的阳性数 实际接种菌量（ 检测样品（份） C 菌显色 106 6 6 6 4 2 4 105 6 5 6 3 3 4 104 6 3 6 1 2 3 103 6 0 3 1 1 0 总计 24 14 18 8 7 11 04 2016 22 对表 4 的数据进行整理后，计算其阳性率得出表 5，创伤弧菌在 5%，在 综合表 1 和表 2数据得出创伤弧菌在 养基上生长最佳，其次是 养基上生长最差。 表 5 创伤弧菌在五种培养基上检出的阳性率 培养基 阳性 阴性 阳性率 8 6 4 10 弧菌显色 11 13 8 16 17 对表 5的五种培养基运用统计学软件（ 行两两比较结果见表 6。 表 6 创伤弧菌阳性检出数的 两两比较 C C C 菌显色 菌显色 菌显色 弧菌显色 2值 值 ： *表示有明显差异。 （ 5）试验菌株在 的阳性检出率明显高于 菌显色，经统计学分析差异有显著性（ P m 弧菌显色 六、 征 求意 见和采 纳意见 情况 ： 2015 年 10 月 27 日 在北戴河河北省气功疗养院召开了河北省地方标04 2016 23 准专家论证会，会上邀请了省卫计委综合监督执法局、河北农业大学、河北科技大学、衡水学院生命科学学院、国家葡萄、葡萄酒质量监督检验中心和 5个市级疾控中心的 15位专家，提出意见 10条，其中采纳和部分采纳的意见 9条。根据大多数专家的意见，形成了征求意见稿。 04 2016 6 专家论证会征求意见汇总处理表 标准名称：食品安全地方标准 创伤弧菌检验 序号 标准章 条编号 修改建议 理由 提出单位 /个人 采纳与否及其理由 1 标准名称 “食品中创伤弧菌检验 ”改为“创伤弧菌检验 ” 与正文名称一致。 与会专家 采纳 2 封面 01 2015 改为04 2016 标准编号由秘书处统一发放 与会专家 采纳 3 前言 “本标准按 。 不需要写入前言 与会专家 采纳 4 范围 “本程序 ”改写为 “本标准 ” 规范用词 与会专家 采纳 5 范围 “食品中创伤弧菌 ”改为 “水产品中创伤弧菌 ”。 食品范围太大 与会专 家 采纳 6 2 术语和定义 建议修改术语定义，本标准删除该条文。 参考国家标准删除该条文 与会专家 采纳 7 3 设备和材料 增加全自动微生物生化鉴定系统 检验过程可使用该仪器 与会专家 采纳 8 图 1 “氯化酶 ”改为 “氧化酶 ” 书写错误 与会专家 采纳 9 表 2注： T 习惯用法 与会专家 未采纳， 2014 年发表 标即为 0 附录 A 分子式修改下标 规范书写格式 与会专家 采纳 04 2016 6 2016 年 8 月 23 日，省卫生计生委在石家庄市召开 河北省食品安全地方标 准 创伤弧菌检验（送审稿）专家审查会，邀请 赵景石，张伟，田洪涛，李书国，吴荣荣，周立强，孟卫东，任卫红，王建红，张永顺，门金良，李素红，牟德华共 13 位专家对本标准进行审查。 省卫生计生委食品处唐继刚副处长对河北省食品安全地方标准的制定工作情况进行了介绍，省卫生计生委食品处处长陈平对河北省食品安全地方标准 创伤弧菌检验（送审稿）的专家论证会提出了要求。专家组推选张伟为组长， 吴荣荣为秘书 。 河北省食品安全地方标准 创伤弧菌检验（送审稿）标准制定组介绍了项目起草的基本情况和起草过程，以及采用该方法检测水 产品中创伤弧菌的实验流程和实际应用的效果。与会专家在审阅了标准（送审稿）并听取标准起草单位汇报的基础上，经过质疑、答辩和讨论，给予了一些建议如下： 1、文本格式方面，建议文本中“设备和材料”部分的编号与其他章节统一；在表 2中连接符号“ -”使用英文“ -”，并规范行间距等文本格式。 2、考虑到带壳水产品在样品处理过程中有时需要用到锤子、刀子等工具，在设备和材料中的 j)无菌手术剪、镊子后加上 “等”。 3、图 1创伤弧菌检验程序中为样品 25g,建议图 1创伤弧菌检验程序和标准正文中统一描述为样品 25g( 4、 标准正文 选择生化鉴定试剂盒”，建议修改为“可选择生化鉴定试剂盒和全自动微生物鉴定系统”。 与会专家经过讨论，形成如下审查意见： 创伤弧菌是一种革兰氏阴性嗜盐菌，栖息于河口和海洋环境中 ,能够引起胃肠炎、伤口感染和原发性败血症，为全球重要的海洋致病细菌，与 霍乱 弧菌、副溶血弧菌并列为造成人类感染疾病的三大弧菌。人类感染创伤弧菌主要是食用生的或半生的受到 污染的海产品，或者是伤口接触了带菌的海水或海产品。因此，制定河北省食品安全地方标准 创伤弧菌检验具有重要意义。 该标准制定了水产品中创伤弧菌的检验方法，适用于河北省水产品中创伤弧菌的检04 2016 7 验。该标准（送审稿）编写规范，思路清晰，科学合理，先进可行，可操作性强。达到国内领先水平。 审查结论：与会专家一致同意该标准 (送审稿 )通过审查。 七、 参考文献： 1. 004 “