水果蔬菜中六种链格孢霉毒素的测定液相色谱串联质谱法

ICS . . B DB34安徽省地方标准DB 34/ XXXXXXXXX水果蔬菜中六种链格孢霉毒素的测定液相色谱-串联质谱法Determination of six Alternaria toxins residues in fruit and vegetable by UPLC-MSMS（2019-09-10）XXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施安徽省市场监督管理局发布DBXX/ XXXXXXXXX前 言本标准按照GB/T1.1-2009 给出的规则起草。本标准由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：农业部农产品质量安全风险评估实验室（合肥）、池州市农产品质量安全监测中心、合肥市农产品质量检测检验中心、阜阳市农产品质量安全监测中心、繁昌县农业技术推广中心、潜山市种植业服务中心。本标准起草人：董旭、孙明娜、褚玥、童舟、许四五、商鲁宁、范希芹、高宗仙、朱松涛、何志刚、王梅、段劲生、高同春。水果蔬菜中六种链格孢霉毒素的测定液相色谱-串联质谱法1 范围本标准规定了水果和蔬菜中交链格孢酚、交链孢酚单甲醚、交链孢霉烯、细格菌素、细交链格孢酮酸、腾毒素六种链格孢霉毒素残留量的液相色谱串联质谱法中的原理、试剂与材料、主要仪器和设备、分析步骤、测定、结果计算、方法的准确度和精密度和色谱参考图。本标准适用于梨、葡萄、猕猴桃、苹果、柑桔、西红柿、黄瓜、白菜、辣椒等样品中交链格孢酚、交链孢酚单甲醚、交链孢霉烯、细格菌素、细交链格孢酮酸、腾毒素六种链格孢霉毒素残留量的测定。本标准的方法定量限为0.01 g/g。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 8855-2008 新鲜水果和蔬菜 取样方法GB/T 6379.1 测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义GB/T 6379.2 测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 原理试样用含甲酸的乙腈和水混合溶液提取后，经分散固相萃取后氮气吹干，用含甲酸的乙腈溶液复溶，用超高效液相色谱反相分离，三重四级杆质谱仪测定，外标法定量。4 试剂与材料水为GB/T 6682 规定的一级水 。以下凡是无特殊注明的试剂均为分析纯。4.1乙腈：色谱纯。4.2甲酸：色谱纯。4.3无水硫酸镁：分析纯。4.4氯化钠：分析纯。4.5 无水乙酸铵：色谱纯，纯度99。4.6细交链格孢酮酸（Tenuazonic acid, TeA），分子量197.3，化学分子式C10H15NO3，CAS号：610-88-8，标准品纯度98.0。4.7交链格孢酚（Alternariol, AOH），分子量258.23，化学分子式C14H10O5，CAS号：641-38-3，标准品纯度98.0。4.8交链孢酚单甲醚（Alternariol monomethyl ether, AME），分子量273.2，化学分子式C15H12O5，CAS号：26894-49-5，标准品纯度98.0。4.9细格菌素（Altenusin, ALS），分子量290.3，化学分子式C15H14O6，CAS号：31186-12-6，标准品纯度98.0。4.10交链孢霉烯（Altenuene, ALT），分子量292.28，化学分子式C15H16O6，CAS号：889101-41-1，标准品纯度98.0。4.11腾毒素（Tentoxin, Ten），分子量414.5，化学分子式C22H30N4O4，CAS号：28540-82-1，标准品纯度98.0。4.12微孔过滤膜（PTFE聚四氟乙烯）：13 mm0.22 m。4.13标准溶液4.13.1标准储备液:分别准确称取适量的六种链格孢霉毒素，用色谱乙腈配置成浓度为 1000 g/mL的标准储备液，于 04 下避光保存。4.13.2混合标准储备液:分别吸取适量的六种链格孢霉毒素的标准储备液，用色谱乙腈配置成浓度为 100g/mL的混合标准储备液，于 04 下避光保存。4.13.3混合标准工作液：将六种链格孢霉毒素的混合标准储备液，用色谱乙腈稀释，配置成质量浓度分别为1.0 g/mL、0.5 g/mL 、0.2 g/mL 、0.1 g/mL、0.05 g/mL、0.02 g/mL、0.01 g/mL和0.005 g/mL的标准工作溶液，待用。标准工作液需现配现用。4.13.4基质混合标准工作液：将六种链格孢霉毒素的混合标准储备液，用样品空白液稀释，配置成质量浓度分别为1.0 g/mL、0.5 g/mL 、0.2 g/mL 、0.1 g/mL、0.05 g/mL、0.02 g/mL、0.01 g/mL和0.005 g/mL的基质混合标准工作溶液，待用。基质混合标准工作液需现配现用。5 主要仪器和设备5.1超高效液相色谱串联质谱仪：配有电喷雾（ESI）离子源。5.2高速均质机。5.3离心机。5.4涡旋仪。5.4氮吹仪。5.5电子天平：感量0.01g和0.1 mg。6 分析步骤6.1 试样的制备与保存按照GB/T 8855-2008的规定抽取不少于3000 g 样品，取可食部分切碎，充分混匀后高速匀浆，取一定重量样品，放入洁净试样瓶中密封，贴上标签，并置于-20 条件下保存，待测。6.2试样处理6.2.1 提取及净化称取匀浆试样2.5 g（精确至0.01 g），置于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入10 mL乙腈（含0.1%甲酸）和2.5mL超纯水，12000r/min高速均质2分钟，加入3.0g无水硫酸镁和1.0g氯化钠，3000r/min涡旋2 min，室温静置10min后，4000r/min离心10分钟，移取上清液4.0 mL至10 mL离心管，氮吹近干，加入1 mL乙腈-5mM乙酸铵溶液复溶（20/80，v/v）,过0.22m PTFE聚四氟乙烯滤膜，上机。6.3 测定6.3.1液相色谱条件色谱柱：C18柱， 50 mm 2.0 mm（内径）或相当，粒度1.6 m或相当；柱箱温度：40 ；流动相：A- 5mM乙酸铵水溶液，B-5mM乙酸铵甲醇溶液；流速：0.3 mL/min；进样体积：10 L；流动相梯度洗脱程序见表1表1 梯度洗脱程序梯度时间/min流动相比例/（%）流动相A流动相B0.090100.570304.010905.510906.790108.090106.3.2质谱条件离子源：电喷雾离子源（ESI），450 ，离子源接口电压：4.5 KV；扫描方式：正/负离子模式；检测方式：多反应监测MRM； 雾化气3 L/min、干燥气15 L/min均为高纯氮，碰撞气氩气230 KPa； 脱溶剂管温度：250 ； 参考条件和定性离子对、定量离子对见表2表2 MRM检测参数中文名称英文名称ESI模式前体离子m/zMRM离子对m/z碰撞电压1(V)CE碰撞电压2(V)交链格孢酚Alternariol(AOH)M-H-257.00215.20*13.028.022.0213.1513.022.021.0交链孢酚单甲醚Alternariol monomethyl ether(AME)M+H+273.20128.20*-10.0-49.0-14.0115.15-13.0-53.0-12.0交链孢霉烯Altenuene(ALT)M+H+293.20257.05*-11.0-15.0-19.0275.05-11.0-10.0-21.0细格菌素Altenusin(ALS)M-H-289.00245.15*11.018.025.0230.2011.022.023.0细交链格孢酮酸Tenuazonic acid(TeA)M-H-196.05139.15*10.022.026.0112.1510.025.021.0腾毒素Tentoxin(Ten)M+H+415.4058.15*-12.0-29.0-23.0312.20-10.0-21.0-23.0*为定量离子6.3.3测定 取交链格孢酚、交链孢酚单甲醚、交链孢霉烯、细格菌素、细交链格孢酮酸、腾毒素六种链格孢霉毒素的系列混合基质标准工作溶液（4.13.4）及试样溶液各10 L，注入超高效液相色谱串联质谱仪进行分析，用外标法定量。6.4平行试验 按以上步骤，对同一试样进行平行测定。 6.5空白实验 除不加试样外，均按上述步骤测定。7 结果计算7.1试样中的链格孢霉毒素含量按公式(1)计算： (1) 式中： R 样品中残留量（g/g）； S 样液中链格孢霉毒素的峰面积；C 基质标准溶液的浓度（mg/L)；V 样液最终定容体积（mL）； 基质标准溶液中链格孢霉毒素的峰面积；m 称取的试样量（g）。注：计算结果应扣除空白值。8 方法的准确度和精密度8.1 准确度本方法在0.01g/g0.2 g/g添加浓度范围内的回收率在75%110%之间。8.2 精密度本标准精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的，获得重复性和再现性的值是以95%的可信度来计算，本标准方法的精密度数据参照附录A。9 色谱参考图见附录B。附 录A（资料性附录）六种链格孢霉毒素精密度数据表中文名称英文名称含量（g/g）重复性限r再现性限R含量（g/g）重复性限r再现性限R交链格孢酚Alternariol(AOH)0.010.0016 0.0029 0.20.0095 0.0126 交链孢酚单甲醚Alternariol monomethyl ether(AME)0.010.0016 0.0018 0.20.0129 0.0208 交链孢霉烯Altenuene(ALT)0.010.0011 0.0014 0.20.0073 0.0155 细格菌素Altenusin(ALS)0.010.0011 0.0016 0.20.0106 0.0110 细交链格孢酮酸Tenuazonic acid(TeA)0.010.0011 0.0012 0.20.0114 0.0164 腾毒素Tentoxin(Ten)0.010.0012 0.0020 0.20.0119 0.0139 附 录 B（资料性附录）参考谱图图1 交链格孢酚色谱图图2 交链孢酚单甲醚色谱图图3 交链孢霉烯色谱图图4 细格菌素色谱图图5 细交链格孢酮酸色谱图图6 腾毒素色谱图图7 交链格孢酚质谱图图8 交链孢酚单甲醚质谱图图9 交链孢霉烯质谱图图10 细格菌素质谱图图11 细交链格孢酮酸质谱图图12 腾毒素质谱图