《食品安全地方标准 植物源性食品中α-玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮的测定 液相色谱-质谱质谱法》 编制说明

食品安全地方标准 植物源性食品中 液相色谱 质谱法 编 制 说 明 （ 送审稿 ） 吉林省 农业科学院 二 一 二 年 十 一 月 目 录 一、 研究背景 2 二、 任务来源 2 三、 制定 本 标准的必要性和意义 2 四、 标准制定 的 主要 过程 3 五、 制定标准 的原则和依据 4 六、 标准主要条款的说明 4 1、标准的名称 4 2、标准的范围 4 3、方法原理 5 4、前处理条件 5 5、仪器分析条件 6 6、检出限 9 7、线性范围 1 0 8、准确度、精密度 11 七、 标准验证情况说明 1 3 八 、 验证结论 1 3 九、本标准作为强制性地方标准的建议 1 3 十、贯彻标准要求和措施建议 1 4 十一、参考文献 1 4 1 一、 研究背景 玉米赤霉烯酮类毒素及其代谢产物具有雌激素类物质的生物活性，食品中的该物质通过食用逐渐在人体内蓄积，造成人体性激素机能紊乱及影响第二性征的正常发育，在外部条件诱导下，可能致癌。尤其是对女婴的危害更为严重，易造成性早熟。随着研究的深入，人们已经认识到只进行玉米赤霉烯酮是不够的，同时对食品中 能正确评价其污染程度及潜在风险。目前国内各科研机构正积极开展农产品安全生产、检测、监督管理和风险评估的研究，其中食品中 玉米赤霉烯酮及其次生代谢物的测定是重要的研究内容之一。 二、 任务来源 任务来源：吉林省卫生厅 任务编号： 32 - 2012 归口单位：吉林省 农业委员会 起草单位：吉林省 农业科学院 三、 制定 本 标准的必要性和意义 玉米赤霉烯酮的检测技术相对已经成熟，其中高效液相色谱法使用最为广泛，目前国家标准使用的全部为高效液相色谱法，但是该方法有 一个弊端，就是定性能力较差，检测中往往造成假阳性，且灵敏度不高。而液相色谱 质谱法则可很好的解决这两个问题。同时玉米赤霉醇是玉米赤霉烯酮的主要代谢产物，同样具有类雌激素作 用，若玉米赤霉烯酮或玉米赤霉烯醇，两个指标中，有一项明显偏高，则致病的几率则大大增加。目前对玉米赤霉醇检测标准仅有用于动物源性食品检测的，而植源性食品中没有检测方法。在此情况下，我们提出植物源性食品中 液相色谱 质谱法地方标准的制订，是非常具有前瞻性及先进性的，可以弥补监管机构和质检机构对植物源性食品中玉米赤霉醇检测无标准可依的现状，使检测方法统一化、规范化、标准化。 四、 标准制定的主要过程 1、 前期工作 （一）调查研究阶段： 2012 年 1 月 2012 年 6 月 该标准立 项后，标准起草小组立即着手进行有关 业标准、国际标准和国外先进标准查新工作，同时咨询了国内相关专家的意见和建议。在大量收集、整理和分析国内外在该研究领域的有关技术资料，并按制定标准的要求进行分类整理的基础上，明确了标准制定的技术路线。 （二）起草阶段： 2012 年 7 月 2012 年 11 月 标准起草小组按照计划任务书的要求，结合专家咨询意见建议以及其它制定标准的要求，研究建立标准方法的实验方案，并进行条件试验。 起草人员认真查阅了标准制定的有关文件，通 过参加标准宣贯培训， 对标准的格式、内容、术语表达方式等进行了深入学习，严格遵循 准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写和 准编写规则 第 4 部分 :化学分析方法给出的规则起草了植物源性食品中 液相色谱 质谱法。起草小组成员对标准的草案进行了多次修改，形成了征求意见稿。 向吉林省食品药品检验所等 10 个检测机构发出了征求意见稿，有 6 个机构提出了修改意见， 征求专家意见汇总处理表 见附件 1。 （三） 实验室间的 验证工作 ： 2012 年 11 月 2012 年 11 月， 我们选定了 吉林省产品质量监督检验院等 省内三家权威的检测机构进行了 实验室间的 比对 验证工作。通过统计分析各个实验室的检测数据，验证了方法的准确度和精密度、检出限等。参加验证的实验室一致认为：该方法适用于测定 植物源性食品中 含量，具有测定结果准确可靠、操作简单、快速等特点。 验证 报告 见附件 2。 五、 制定标准的原则和依据 本标准编制遵循 “先进性、实用性、统一性、规范性 ”的原则，尽可能与国际通行标准接轨，注重标准的可操作性，严格按照 准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写规则和 准编写规则 第 4 部分：化学分析方法的要求进行编写。 六、 标准主要条款的说明 1、 标准的名称 植物源性食品中 液相色谱 质谱法 2、 标准的范围 本标准规定了植物源性食品中 质谱 /质谱测定方法。适用于成品粮及其加工制品（面粉、淀粉等）、 食用植物油脂及其加工制品 等中 3、 方法原理 试料 中 霉烯酮经三氯甲烷提取，采用碱性水溶液 萃取并调至中性后，再经 二氯甲烷萃取后，使用液相色谱 质谱仪测定，外标法定量 。 4、 前处理条件 取 称取试料 10 g（精确至 g）于 100 塞锥形瓶中。 固体样品 加入50 氯甲烷（ 植物油脂样品加入 35 氯甲烷（ ， 盖紧塞子，于振荡提取器上（ 振荡提取 30 化 使用中速滤纸过滤提取液（ 并用三氯甲烷定容至 50 1)。 吸取25.0 取液 ( 125 液漏斗（ ，加入 5 和氯化钠溶液（ 混匀，再 加 入 25 %氢氧化钠（ 液，剧烈振荡 1 置分层，弃去三氯甲烷层。 再用 25 氯甲烷 重复 萃取一次，弃去三氯甲烷层。加入 25 檬酸溶液（ ， 混匀。 再 加入 25 氯甲烷（ 剧烈振荡 1 置分层。 将 二氯甲烷层溶液通过装有 5 g 无水硫酸钠（ 漏斗。 再用 25 氯甲烷重复萃取一次，操作同上。 另用 5 氯甲烷冲洗无水硫酸钠，合并二氯甲烷萃取液 至 浓缩瓶中， 40 以下于旋转蒸发仪上浓缩至近干 。残 留 物用 5 氯甲烷溶解并转移至玻璃离心管中，于40 以下用微弱氮气吹干，残留物用 1.0 腈 解， 于漩涡混合器上（ 漩涡混匀后，过 膜 （ ，供仪器测定 。 处理条件的确定 取溶剂的选择 比较了三氯甲烷、乙腈、无水乙醚三种提取溶剂的提取效果 。其中三氯甲烷和乙醚提取效率较高，考虑到乙醚挥发性高，操作过程中不易控制，因此我们选择了三氯甲烷作为提取溶剂。 取时间的选择 比较了 10203060果发现随着提取时间的增加，提取效率不断提高， 30后不再增加，因此确定 30 此选择氢氧化钠作为第一次萃取的溶液，以除去脂类和色素等脂溶性的杂质。对 1%、 2%和 3%四种浓度的氢氧化钠的萃取效率进行了比较，发现氢氧化钠的浓度为 2%时较为合适。 5 仪器参考条件 谱参考条件 a） 色谱柱： 谱柱， 100 .1 径 m； b） 柱温： 40 ； c） 流动相、流速及洗脱梯度：流速 0.3 mL/脱梯度见表 1； d） 进样量： 30 L。 表 1 流动相、流速及洗脱梯度 时间 /速 /（ mL/ A 相：水 /% B 相：乙腈 /% 0 50 5 75 100 100 00 0 00 0 谱参考条件的确定 比较了甲醇和水、乙腈和水作为流动相的洗脱效果，发 现两者相当。但是甲醇和水用作流动相时系统压力较高，因此选择了乙腈和水系统作为流动相。 对于 用 50%乙腈等度系统和梯度洗脱时分离效果相当，等度洗脱时分析时间较长，同时梯度洗脱可有效除去极性较弱的杂质，因此选择了梯度洗脱的方式。 比较了 501005018色谱柱，发现100分析较短， 4此选择了 100 .1 粒径 m）的 a）电离方式：电喷雾电离； b）扫描方式：负离子扫描； c）检测方式：多反应监测（ d）离子源温度： 350 ； e）干燥气流量： 10 L/ f）监测离子、去簇电压及碰撞能量：见表 2。 表 2 簇电压及碰撞能量 化合物名称 监测离子 去簇电压 碰撞能量 319/275a； 319/160 15； 米赤霉烯酮 317/175a； 317/131 25； 谱参考条件的确定 对扫描方式、离子源温度和干燥气温度等进行了优化，确定出最佳的质谱条件。对 撞能量等进行了优化，同时参考相关标准和文献筛选出最佳的定性和定量离子对。 准溶液、 玉米 空白样品、 玉米加标 样品 多反应监测（ 谱图 按照确定的前处理方法和仪器参考条件对 标准溶液、 玉米空白样品、玉米 、大豆、淀粉、花生、小麦面粉、大米、芝麻油、玉米油及大豆油等样品的空白 加标 进行 测定，多反应监测（ 谱图见图 1图 11。 图 1 0.5 ng/准溶液 谱图 图 2 空白玉米样品 谱图 图 3 空白玉米 样品 加标 谱图 图 4 空白 大豆 样品 加标 谱图 图 5 空白 淀粉样品 加标 谱图 图 6 空白 花生样品 加标 谱图 图 7 空白 小麦面粉样品 加标 谱图 图 8 空白 大米样品 加标 谱图 图 9 空白 芝麻油样品 加标 图 10 空白 玉米油样品 加标 图 11 空白 大豆油样品 加标 6、 检出限 和定量限 以信噪比为 3时计算方法的检出限 。 以样品取样量为 10 g，确定 mg/mg/信噪比为 10时计算方法的定量限限 。 以样品取样量为 10 g，确定 mg/mg/、 线性范围 配制了 ng/ng/ng/ng/10.0 ng/0.0 ng/50.0 ng/100 ng/不同浓度系列 准溶液上机测定 ， 结果发现 ng/20.0 ng/性曲线见图 6 和图 7。 图 6 图 7 玉米赤霉烯酮线性曲线图 8、 回收率、 准确度 和 精密度 在 玉米、大豆、水稻、花生、 玉米 淀粉、面粉、大豆油、玉米色拉油、芝麻油等 空白 样品 中 加入 玉米赤霉烯酮 标准物质 ， 进行 回收率 与精密度实验 。 实验 室内回收率及 重复性 测定 结果见表 3，实验室间回收率及 再现性 测定结果见表 4。 表 3 不同基质空白样品中 n=6） 样品名称 被测组分 添加浓度 /(g/回收率范围 /% 相对标准偏差 /% 玉米 米赤霉烯酮 豆 米赤霉烯酮 稻 米赤霉烯酮 生 米赤霉烯酮 米淀粉 米赤霉烯酮 粉 米赤霉烯酮 豆油 米赤霉烯酮 米色拉油 米赤霉烯酮 麻油 米赤霉烯酮 3 不同基质空白样品中 和玉米赤霉烯酮添加回收率及精密度（ n=6） 样品 项目 添加水平 /(g/平均测定回收率 /% 平均值 /% 吉林省 质检院 吉林商检 长春市 质检院 本所 玉米 赤霉烯醇 12 60 玉米赤霉烯酮 60 大豆 赤霉烯醇 12 60 玉米赤霉烯酮 60 大米 赤霉烯醇 12 60 玉米赤霉烯酮 60 玉米油 赤霉烯醇 12 60 玉米赤霉烯酮 60 七、 方法验证 本方法经 吉林省产品质量监督检验院、吉 林出入境检验检疫局技术中心、长春市产品质量监督检验院等 三个实验室的技术人员进行了方法验证试验 。 八、 验证结论 经验证该检测方法在精密度、准确度、检出限等方面完全达到了测定 植物源性食品中 测要求，其方法方便、快捷，应推广应用。 九、本标准作为强制性地方标准的建议 通过以上一系列的实验研究，建立了 植物源性食品中 测方法。该方法准确可靠。 建议把 植物源性食品中液相色谱 质谱法 作为强制性地方标准批准发布。 十、 贯彻标 准要求和措施建议 1、技术措施 要求熟练掌握前处理技术，了解仪器性能、原理，且能熟练操作，能对检测结果进行分析。 2、管理措施 本技术标准在实施过程，严格执行检验规范，熟悉检验方法和有关的法规，做到科学、公正、准确、不受其他因素干扰，确保检验结果的准确可靠。 3、实施方案 标准由吉林省卫生厅发布，计划于 发布实施，由 政主管部门负责监督实施。 标准被批准后，组织力量，进行宣贯实施，通过该标准的贯彻实施，确保食品安全和保障人体健康等方面将产生巨大的经济效益和社会 效益。 十一、 参考文献 1 物中玉米赤霉烯酮的测定 . 2 T 21982物源食品中玉米赤霉醇、 米赤霉酮和玉米赤霉烯酮残留量检测方法 液相色谱 质谱法 . 3 23504品中玉米赤霉烯酮的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱法 . 4 22963豚鱼、鳗鱼和烤鳗中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、乙烯雌酚、已烷雌酚、双烯雌酚残留量的测定 液相色 谱 5 1745出口大豆、油菜籽和食用植物油中玉米赤霉烯酮的检验方法 . 61772出口粮谷中玉米赤霉烯酮的测定 免疫亲和柱 75792： 2009 of in 8in 988. 9孟娟、张晶、张楠等 超高效液相色谱 色谱， 2010,28（ 6）： 601