基础细胞实验必备技能

.第三节 实验相关试剂和缓冲液的配制表2.3 1ml细胞裂解液的配制方法组分浓度NaClTris ( pH 8.0 )150 mM50 mMTriton X10 lAprotininLeupeptin5 l5 lPMSF1 mM表2.4 SDS-PAGE凝胶的配制方法分离胶(8ml)浓缩胶(4ml)Acrylamide concentration30% Acrylamide mix1.5 M Tris pH 8.81 M Tris pH 6.8H2O10% SDS10% Ammonium PersulfateTEMED10%2.67 ml2ml2.72 ml80 l80 l6 l12%3.2 ml2 ml2.64 ml80 l80 l8 l4%0.54 ml0.5 ml1.2 ml40 l40 l3 l表2.5 SDS-PAGE电泳缓冲液配制方法组分浓度Tris baseGlycineSDS0.025 M0.25 M0.1% (W/V)表2.6 转膜缓冲液的配制方法组分浓度Tris baseGlycineMethanol25 mM0.2 M20%表2.7 TBST漂洗液的配制方法组分浓度NaClTris-HClTween 20150 mM20 mM0.05% (V/V)表2.8 细胞质蛋白提取液的配制方法组分浓度HEPES10 mMMgCl21.5 mMKCl10 mMDTT0.5 mMNP-400.05% 表2.9 细胞核蛋白提取液的配制方法组分浓度HEPES5 mMMgCl21.5 mMEDTA0.2 mMDTT0.5 mMglycerol26% 表2.10 1L的PBS缓冲液的配制方法组分含量KCl8 gNaCl0.2 gNa2HPO42H2O1.78 gKH2PO42.7 g表2.11 500ml TBE缓冲液的配制方法组分含量Tris base2.7 gBoric acid1.375 gEDTA（0.5M PH=8.0）1 ml表2.12 明胶酶谱洗脱液的配制方法组分浓度Triton X2.5%Tris-HCl (PH=7.4)50 mMCaCl25 mMZnCl21 mM表2.13 明胶酶谱孵育液的配制方法组分浓度Sodium Azide0.01%Tris (PH=7.4)50 mMCaCl25 mMZnCl21 mM表2.14 明胶酶谱染色液的配制方法组分浓度Coomassie G2500.5%Ethanol30%Acetic acid10%表2.15 明胶酶谱脱色液的配制方法组分浓度Ethanol30%Acetic acid10%表2.16 5蛋白质上样缓冲液的配制方法组分浓度Tris-HCl250 mMSDS10% (W/V)BPB0.5% (W/V)甘油50% (V/V)-巯基乙醇5% (W/V)第四节 实验方法2.4.1 小鼠的小胶质细胞系(BV2)和人的多巴胺能神经元细胞（SKN-SH）的培养条件小鼠的小胶质细胞是半贴壁细胞，用含有10% FBS和1%双抗（青霉素：链霉素=1:1）的Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)高糖培养液，于37、5% CO2的条件下进行培养，当细胞基本铺满培养瓶瓶底时即可传代，一般2天传代一次。人的多巴胺能神经元细胞为贴壁细胞，为了减少多巴胺能神经元细胞的分化，用含有10%FBS和1%双抗的Minimum Essential Medium （MEM）于37、5% CO2的条件下进行培养，当细胞基本铺满培养瓶瓶底时即可传代，一般3-4天传代一次。2.4.2 细胞传代小胶质细胞于对数生长期并基本铺满培养瓶瓶底时进行传代，此时细胞生长状态良好。倒出培养液，分别用3mL提前37预热的PBS冲洗2次，加1mL新培养液，用手拍打细胞培养瓶，倒置显微镜下观察，当BV2细胞基本从瓶壁脱落后，用电动移液器反复吹打细胞直至成单细胞悬液状态，将细胞悬液按1:5分瓶的比例加入新的培养瓶中继续培养，一般2天传一次代。人的多巴胺能神经元细胞的传代为，于细胞生长状态良好（即处于对数生长期时）并铺满瓶底时进行传代。首先倒出培养液，分别用3mL提前37预热的PBS冲洗2-3次，然后加入约200 l左右的胰酶进行消化，将培养瓶放入培养箱中静置3 min，待细胞从培养瓶瓶壁上脱落后，立即加入1ml的培养液终止消化，用电动移液器反复吹打培养液使得细胞从集落状分散成为单细胞悬液，将细胞悬液按照1:4的分瓶比例分到新的培养瓶中继续培养，一般3天左右传一次代。2.4.3 细胞冻存取对数生长期且生长良好的细胞，用37预热的PBS冲洗3次，加200l胰酶进行消化，加入预先配制好的冻存液（10% DMSO+ 20% FBS+70%培养液），用电动移液器吹打细胞成单细胞悬液，将含有细胞的冻存液分装于冻存管中，每管1 ml左右。为了减少突然降温对细胞的损害，将冻存管放入含有异丙醇的冻存盒中于-70超低温冰箱中程序降温，24小时后将冻存管转移至液氮罐中长期保存。2.4.4细胞复苏从液氮罐中取出冻存管，将冻存管置于空气中一会，使得液氮能够充分气化，防止冻存管突然放于37水浴后液氮大量气化引起的爆炸。将冻存管置于37水浴中，待冻存液完全融化后，短暂低速离心（1000rpm 5min），弃上清，将下层含细胞的液体转移至培养瓶中，加入培养液于37，5% CO2培养箱中培养，倒置显微镜下观察，待细胞完全贴壁后，更换培养液继续培养。2.4.5细胞的药物处理将待处理细胞种于细胞培养板中，24小时后待细胞处于良好生长状态即给予药物处理。待处理化合物一般需要提前30 min预处理，然后依据实验所需给予不同处理，于不同时间点收取细胞。之后提取细胞内的总蛋白，核蛋白，质蛋白，总RNA等。蛋白质免疫印迹法检测细胞内蛋白质表达量的变化，用RT-PCR检测细胞内mRNA含量的变化，用ELISA法检测细胞因子的蛋白含量。2.4.6 MTT法检测细胞存活率待处理细胞按每孔1104个细胞的浓度，100 l的体积种于96孔板中。细胞于37、5%CO2的培养箱中培养，24小时后用不同浓度的待处理化合物处理，20小时后，在每孔中加入20 l MTT（5mg/ml，用PBS配制，MTT见光极易分解，故配置时要注意避光），37孵育4个小时，弃上清，每孔中加入150 l DMSO。震荡约10 min后，将96孔板放于酶标仪中，在波长490 nm下检测其吸光度值，根据吸光度值计算出细胞存活率。2.4.7 小胶质细胞NO释放量的测定将处于对数生长期的小胶质细胞按照密度为3105细胞/孔的浓度接种于12孔板中，每孔接种0.6ml，24小时后，待细胞生长状态良好，加入不同浓度的待处理化合物，预处理30 min后，加入脂多糖（LPS）至终浓度为0.2 g/ml，继续培养24小时后，取50 l细胞培养上清，分别加入50 l Griess试剂（A液：B液=1:1，A液含有1%的磺胺，5%的磷酸，B液为0.1%的-萘乙二胺二盐酸盐，A,B液需要避光保存），室温反应10min，于548 nm波长下测吸光度值，根据吸光度值和标准曲线计算出NO浓度。2.4.8蛋白免疫印迹法（western blotting）检测小胶质细胞中蛋白质表达量2.4.8.1总蛋白样品的提取将药物处理过的培养板从培养箱中取出，放置于冰上，用4预冷的PBS缓冲液冲洗12孔细胞培养板2次，每孔加0.6 ml预冷的PBS（如若待检测蛋白质为磷酸化的蛋白质则PBS中需要分别按100:1的比例加入0.1M 氟化钠和2mM活化后的原钒酸钠），用移液器反复吹打培养板内的细胞或用细胞刮刮细胞，直至细胞全部悬浮于PBS中，将细胞悬液转移至1.5ml EP 管中，将EP管置于4离心机中，先以2000 rpm的转速离心3 min，再以5000 rpm的转速离心5 min。倒掉PBS，向每管中加入20-40 l 蛋白裂解液（蛋白裂解液中含有2%的蛋白酶抑制剂，1%PMSF，如若待检测蛋白质为磷酸化的蛋白质则蛋白裂解液中需要分别按100:1的比例加入0.1M 氟化钠和2mM活化后的原钒酸钠），每5 min用漩涡混合器剧烈震荡1次，裂解30min。7次裂解后，将EP管置于4低温离心机中，12000 rpm，离心10 min，转移含有蛋白质的上清至0.6 ml的EP管中。2.4.8.2 BCA法蛋白定量1. 将BCA定量试剂盒中A:B液按50:1的比例混合，取96孔板，每孔加入混合液200 l，再加入浓度梯度为：0、1、3、5、7 g/l的BSA蛋白标准液各1 l和待测蛋白样品1 l。2. 用微量振荡器震荡混匀30s，于37孵育30 min。3. 将96孔板置于酶标仪中于562 nm波长下检测的吸光度。4. 根据蛋白标准溶液的吸光度值绘制标准曲线，进而依据标准曲线计算出待测蛋白样品的浓度。5. 在收集的蛋白样品中加入5loading Buffer，震荡混匀，置于沸水煮5 min，然后迅速置于冰上冷却，使得蛋白变性，4保存备用。2.4.8.3 SDS-PAGE电泳根据目的蛋白的分子量大小不同配制不同浓度的SDS-PAGE凝胶，分离胶配好后加到制胶板中，室温静置1小时左右，使分离胶充分凝聚。期间配置浓缩胶，浓缩胶配好后加到制胶板中，插好梳子，约1小时左右浓缩胶凝聚。从配制好的胶板中拔出梳子，将胶板置于电泳槽中，加入SDS-PAGE电泳缓冲液，将收集得到的蛋白样品点入浓缩胶的原梳子孔中。将电压调至60 V，电泳约20 min左右，溴酚蓝会在分离胶和浓缩胶界面之间被压成一条细线，同时蛋白的maker会出现条带分离，之后将电压调至100 V，电泳大约1.5小时左右，停止电泳，进行转膜操作。2.4.8.4 转膜剪一块聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），使其稍稍大于待转的SDS-PAGE凝胶，将PVDF膜浸泡在无水甲醇中，使其活化。在转膜缓冲液中，按照顺序安装转膜材料，从电泳正极到负极的顺序依次是：海绵垫，滤纸，PVDF，膜凝胶，滤纸，海绵垫。将膜置于胶上，压紧并用手或玻璃棒挤出可能存在的气泡，合好夹板后放入电泳槽中，补满转膜缓冲液并放上冰盒。为了减缓转膜过程中的放热对实验的影响，最后将整个电泳槽置于冰盒中。100 V转膜1小时。转膜结束后，卸下转膜装置，取出已经转上蛋白的PVDF膜。2.4.8.5 免疫印迹反应1用TBST冲洗转上蛋白的PVDF膜，于摇床上高速洗膜2次，每次5 min。2. 漂洗完毕后倒掉TBST，加入预先用TBST配制好的5%脱脂奶粉封闭液，于摇床上低速室温孵育1小时。3. 封闭结束后，加入TBST，在摇床上高速洗膜3次，每次5 min。4. 用5%脱脂奶粉封闭液按1000:1或2000:1的比例稀释一抗。洗完膜后，弃去TBST，加入配制好的一抗稀释液，4过夜。5. 回收一抗，加入TBST，在摇床上高速洗膜3次，每次5 min。6. 弃去TBST，加入二抗工作液（用5%脱脂奶粉封闭液按羊抗兔15000:1，羊抗鼠5000:1的比例稀释二抗）室温孵育1小时。7. 回收二抗，加入TBST，摇床上高速洗膜3次，每次5 min。8. 将PVDF膜置于暗盒中的保鲜膜上，向膜上均匀滴加配好的发光底物（发光底物由A，B液组成，其比例为A液：B液=1:1），用保鲜膜包好，进入暗室，放置胶片于保鲜膜上，合上暗盒曝光大约1-10 min。曝光结束后打开暗盒，将胶片放入显影液中，待出现明显且清晰的条带时，取出胶片放入水中，漂洗除去未反应的显影液，然后将胶片放入定影液中，待胶片背景于红光下显示变黑，取出胶片置于清水中，漂洗除去未反应的定影液。取出胶片晾干。待胶片晾干后用扫描仪扫描条带，后用image-J 2x软件分析灰度值。2.4.8.6 核蛋白和质蛋白的分离方法1. 质蛋白的提取：用4预冷的PBS缓冲盐溶液漂洗12孔细胞培养板2次。每孔加0.6 ml 4预冷的PBS，然后将12孔板放置于冰上。用移液器吹打细胞至细胞脱落成细胞悬液，转移至1.5 ml EP 管中。将EP管置于4低温离心机中，首先2000rpm离心3 min，然后5000 rpm离心5 min。离心结束后，倒掉PBS，向每管加入20l的质蛋白裂解液（裂解液中含有2%的蛋白酶抑制剂，1%PMSF），漩涡混合器轻微震荡EP管10min。每2 min一次，共6次。将EP管，取上清至另一EP管中（沉淀用来提取核蛋白）。再将EP管置于4低温离心机中，以12000 rpm转速离心10 min。取上清即是质蛋白。用BCA法测定质蛋白浓度后，加入5loading Buffer，于沸水煮5 min，然后迅速置于冰上冷却，4保存备用。2. 核蛋白的提取：质蛋白提取后的沉淀中，每管中加20l核蛋白裂解液（裂解液中含有2%的蛋白酶抑制剂，1%PMSF），漩涡混合器剧烈震荡30min，每5 min一次，共7次。将EP管置于4低温离心机中，以12000 rpm转速离心10 min。取上清即为核蛋白。用BCA法测定核蛋白浓度后加入5loading Buffer，沸水煮5 min，然后迅速置于冰上冷却，4保存备用。2.4.9 RT-PCR法检测小胶质细胞中mRNA的含量2.4.9.1 Trizol法提取细胞总RNA1. 将药物处理好的小胶质细胞从培养箱中取出，用预冷的PBS漂洗12孔板2遍，向每孔中加入600l Trizol试剂，室温静置5 min使之充分裂解。2. 将其全部转至1.5 ml RNase free的离心管中。3. 4，12000 rpm离心5 min，弃沉淀（沉淀为细胞中的一些脂溶性成分），将上清移至新管。4. 向上清中向加入120l氯仿，剧烈颠倒混匀后室温静置3 min（此过程禁止用旋涡混合器）。5. 4，12000 rpm离心15 min。6. 将上层水层相移至另一新离心管中，注意不要吸到中间相。7. 每管中加入0.3ml异丙醇，剧烈颠倒混匀后室温静置15min（此过程禁止用旋涡混合器）。8. 4，12000 rpm离心10 min，弃上清，此时RNA 沉淀于管底。9. 每管中加入4预冷的1 ml 75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀，洗涤总RNA。10. 4，12000 rpm离心5 min，尽量将上清去除干净，室温放置15 min，使乙醇挥发干净。（此过程需要用一次性PE手套盖住管口）11. 待乙醇蒸发完后加50 l DEPC水充分溶解总RNA。12. 向上述RNA水溶液中每管中加入5 l的10DNaseBuffer和1 l RNase-free的DNase，37静置15 min，去除混合在RNA中的DNA。13. 每管中加入100 l比例为25：24：1的苯酚：氯仿：异戊醇的混合溶液，充分颠倒混匀，除去DNA酶。14. 4，3000 rpm 离心1 min。15. 将上清移至一新离心管中，弃沉淀，每管中加入100 l比例为24：1的氯仿：异戊醇混合溶液，充分颠倒混匀。16. 4，3000 rpm离心1 min。17.取上清转移至另一离心管中，每管中加入0.1倍体系体积的 NaAc ( 2M, PH 4.0 )，2.5倍体系体积的-20预冷的无水乙醇，充分颠倒混匀。18. 4，12000 rpm离心15 min，弃上清。19. 向沉淀中加入1 ml 75 %的乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀，洗涤RNA。20. 4，12000 rpm离心15 min。21. 重复前两步一次。22. 弃上清，室温静置15 min，将乙醇挥发干净。23. 每管中加入20 l DEPC水溶解RNA，-70保存。2.4.9.2 紫外分光光度计测样品OD值为检测提取出总RNA的纯度和浓度，用酶标仪测量RNA样品的OD值。因普通96孔板为塑料材质，无法透过紫外光，故测量时用96孔石英板测量。测量前用100 l DEPC水校零。然后从RNA溶液中取1 l溶于99 l DEPC水，使得待测样品稀释100倍，然后进行检测，测得RNA的纯度（以260/280处在1.8-2.0为最适纯度）和浓度。2.4.9.3 RNA反转录1. 取1 g提取好的总RNA样品和1 l的Oligo dT混匀，于PCR仪上70恒温15 min，使RNA保持单链状态，结束后冰上冷却，3000 rpm短暂离心使液体收入管底。2. 按照如下体系加入反转录试剂表2.13 反转录体系试剂每25 l体系所需要加的试剂的量 ( l )M-MLV 5Buffer5dNTP( mix )5RNase抑制剂( 25 units )0.5M-MLV 反转录酶( 200 units )1DEPC水至终体积25 l3. 程序设定如下：42恒温延伸15 min，95 变性5 min，4 恒温1小时。2.4.9.4 PCR反应94预变性3 min，94变性30秒，55退火30秒，72延伸30秒，27个循环，最后72延伸10 min。引物序列如表2.14：表2.14 引物序列基因序列方向均为5- 3iNOS上游引物CAGCTCCTCACTGGGACAGCACAGAiNOS下游引物CTTCCAGCCTGGCCAGATGTTCCTCCOX-2上游引物CAGCAAATCCTTGCTGTTCCCOX-2下游引物TGGGCAAAGAATGCAAACATCGAPDH上游引物GCACAGTCAAGGCCGAGAATGAPDH下游引物GCCTTCTCCATGGTGGTGAATNF-上游引物ACAAGAAAGACAAAGCCAGAGTTNF-下游引物TGACCACAGTGAGGAATGTCCIL-6 上游引物TGTTTTCTGTGAAAAACGGAGC IL-6下游引物ATGACCCGTAGGGCGATTAIL-1上游引物ATGGCAACTGTTCCTGAACTCAACTIL-1下游引物TTTCCTTTCTTAGATATGGACAGGAC2.4.9.5琼脂糖凝胶电泳用0.5TBE缓冲溶液配制浓度为1%的琼脂糖凝胶溶液。微波炉中加热2次，每次1min。室温冷却后加入1l的Gel Red，再倒入模具中等待琼脂糖凝胶凝固。将凝固好的琼脂糖凝胶置于0.5TBE电泳缓冲液中，以120V的电压跑胶14min后，将琼脂糖凝胶置于Bio Rad 照胶仪中显影。2.4.10 酶联免疫分析法小胶质细胞以3105/孔的密度，以0.6ml/孔的体积接种在6孔细胞培养板上，24小时培养后，预处理不同浓度的三个化合物30min，再处理LPS至终浓度为0.2g/ml，24小时培养后取100l细胞上清液，37oC反应90min， 加入100生物素标记的抗体（IL1，IL6，TNF），37oC反应60min，之后加入 0.01M 的TBS洗涤3次，每孔里再加入100l的ABC，37oC反应30min，加入0.01M 的TBS洗涤5次，室温避光反应30分钟。最后加入TMB终止液，于不同波长下读数。2.4.11 条件培养液法小胶质细胞以100 l/孔的体积，以每孔细胞数约为5104个的浓度接种于96孔板。继续培养24小时后，提前30分钟预处理不同浓度的待测药物，然后每孔加入0.2 g/ml的LPS进行刺激。在小胶质细胞处理药物的同时，将SKN-SH细胞按1104细胞/孔的浓度，以100 l/孔的体积接种于96孔板内，培养24小时后，将LPS处理24小时后的小胶质细胞的培养液转移至培养SKN-SH细胞的96孔板中，48小时后加入MTT 20 l，37孵育4个小时，弃去上清，每孔加入200 l DMSO，震荡约10 min，将96孔板置于酶标仪中，在波长为490 nm的波长下检测其吸光度值。2.4.12 DPPH自由基清除实验用50%的乙醇溶液配制浓度为6.510-2mM的DPPH溶液和浓度分别为1M, 10m,100M,500M的待测样品溶液。分别加入不同浓度的20l的样品溶液，至80l的DPPH溶液中，均匀混合，在暗室内避光反应三十分钟，用酶标仪在517nm波长处测量吸光度，计算DPPH自由基清除率。计算公式为清除率CL=1-(Ai-Aj)/A0，式中Ai为20l样品+80l DPPH溶液所测出的吸光度，式中Aj为20l样品+80l的50%乙醇溶液所测出的吸光度，A0为20l的50%乙醇溶液+80l的DPPH溶液所测出的吸光度。以上实验重复三次。2.4.13 明胶酶谱实验2.4.13.1 样品制备将密度为3105个/孔，体积为600l/孔的无血清的小胶质细胞混悬液接种于12孔细胞培养板中，24小时培养后，预处理不同浓度的meso-dihydroguaiaretic acid, schiarisanrin A, heteroclitin D 30min后，加LPS至终浓度为0.2 g/ml，24h培养后，取20l小胶质细胞的上清培养液，加入4的明胶酶谱上样缓冲液，不用煮沸，4度保存。2.4.13.2 SDS-PAGE-明胶凝胶电泳根据目的MMP9的分子量大小配制10%浓度的SDS-聚丙烯酰胺-明胶凝胶，将加有明胶和甘油的分离胶配好后加到制胶板中，室温静置1小时左右，使分离胶充分凝聚。期间配置浓度为4%的浓缩胶，浓缩胶配好后加到制胶板中，插好梳子，约1小时左右浓缩胶凝聚。从配制好的胶板中拔出梳子，将胶板置于电泳槽中，加入SDS-PAGE电泳缓冲液，将收集得到的上清样品点入浓缩胶的原梳子孔中。将电流调至20mA，以恒流的方式，电泳约70 min左右，停止电泳。2.4.13.3明胶酶谱实验电泳结束后,将凝胶取出，置于明胶酶谱洗脱液(2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，1mmol/L ZnCl2，pH7. 4) 中去除SDS并使蛋白酶复性，脱色摇床上振荡洗脱1小时，然后将凝胶置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 1mmol/L ZnCl2，0. 02% 叠氮钠，pH7.4)中，37 孵育过夜，使MMP9的活性得到充分激活。孵育结束后，将凝胶置于考马斯亮蓝染色液(0.5% 考马斯亮蓝G250、30%乙醇、10%乙酸) 中染色30min,使得考马斯亮蓝与未被降解的明胶结合。染色结束后，将凝胶置于脱色液 (30%乙醇、10%乙酸)中脱色10min。脱色完成后，用2%的乙酸溶液终止反应并于37 孵育过夜，将凝胶脱水。最后将凝胶置于丙烯酰胺凝胶成像仪中，通过凝胶图像分析系统读取条带面积。其中位于92 KD分子量大小处呈现的蓝色背景上的透亮带 即为MMP -9的条带。2.4.14 分子对接2.4.14.1待对接的化合物预处理用ChemBioDraw Ultra软件画出三个天然单体化合物的绝对构型，并用Chem Bio3D软件将化合物的平面结构转换成立体结构。转换后，将三个化合物的立体结构导入Sybyl软件进行能量最低优化。2.4.14.2待对接的酶的预处理从Protein Data Bank（http:/www.rcsb.org/pdb）网址中导出待对接的酶与其特异性抑制剂的复合物晶体结构，运用Pymol软件，将晶体结构中的结晶水与特异性抑制剂从复合物的晶体结构中剔除，并确定待对接的活性中心口袋的位置及大小。运用Autodock Tools软件对得到的单纯MMP9的蛋白晶体结构进行加极性氢的优化。如若是Autodock 4.2软件则根据活性中心口袋信息生成参数文件。如若是Autodock vina软件则直接编写对接程序。2.4.14.3分子对接在autodock4.2软件中，设置循环次数为200次，设置待得到的化合物个数为150个。运行autodock 4.2软件，则会生成150个可能性的化合物与酶的活性中心的结合方式。通过能量，位置，构象分析，选取最有可能的化合物的构象，记录此构象与酶的活性中心的结合能大。.