《黄酒中氨基酸测定方法》行业标准编制说明

黄酒 中 氨基酸 的 测定 方法 行业 标准 编制说明 征求意见 稿 黄酒中氨基酸的 测定 方法 行业 标准起草工作组 二 O 一一年 二 月 一、 任务来源 根据发改办工业 20081242 号文件下达的行业标准计划任务，黄酒中氨基酸的测定方法 中国食品发酵工业研究院等负责起草，全国食品发酵标准化中心归口管理。 二、 制标的原则 本标准是按照 准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写规则和准编写的规则 第 4 部分：化学分析方法 的要求编写的。 三 、 标准化 方法研究 过程 本标准起草 工作组 通过查阅 大量国内外氨基酸测定的方法，通过对各方法的特点进行对比分析，结合实验室的条件和方法适用性，选择 异硫氰酸苯酯（ 柱前衍生高效液相色谱法进行测定。对样品的处理方法，衍生反应条件、色谱分离条件等进行了优化，通过回收率、稳定性及精密度等一系列的研究，建立了 液相色谱法 同时进行 天冬氨酸 (谷氨酸 (丝氨酸 (甘氨酸 (组氨酸 (精氨酸 (苏氨酸 ( 4（ 丙氨酸 (脯氨酸 (酪氨酸 (缬氨酸 (蛋氨酸 (异亮氨酸 (亮氨酸 (苯丙氨酸 (色氨酸（ 赖氨酸 ( 18 种氨基酸 分析 方法 。 本方法经过 中国食品发酵工业研究院、 上海金枫酒业股份有限公司、浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司、北京市产品质量监督检验所、 首都师范大学化学系 和中粮酒 业有限公司技术中心 等 6 家 实验室验证， 实验室间的 再现性相对标准偏差 本 小于 10%。 四、 研究背景 氨基酸是一种两性化合物 , 它的分子中既含有氨 基又含羧基 , 由于这两种基团的强弱性不同 , 所以氨基酸既有酸性的也有碱性的 。 饮料酒中氨基酸的种类和含量是影响其风味和衡量其营养质量高低的一项重要指标 。 黄 酒的甜度和酸度主要由糖类和有机酸决 定，而其它诸味则主要决定于游离氨基酸的组成， 黄酒中氨基酸主要来自原料及微生物的代谢作用， 氨基酸赋予了 黄 酒较高的营养价值 。 因此研究 黄 酒中游离氨基酸含量快速、准确的测定方法， 对研究 黄 酒的营养价值和质量控制具有十分重要的 意义 。 国内外早已将氨基酸自动分析仪用于氨基酸的分析测定 , 自动化程度高，测定准确，但是仪器价格昂贵，应用的范围 较窄； 大多数氨基酸缺乏天然的紫外或荧光吸收 , 进行化学衍生化 生成具有紫外或荧光吸收 的化合物 ，然后采用液相色谱法进行测定， 已成为氨基酸分离和分析的重要手段 .。 氨基酸 衍生化 方法可分为两大类： （ 1） 柱后衍生法。 法准确、可靠、重现性好，但缺点是灵敏度不高，仅达到100且需双波长检测（ 440570随后，有人用荧光胺、 用荧光检测，灵敏度提高了三个 数量级，但其不与二级氨基酸（如脯氨酸）反应。 （ 2） 柱前衍生法。相对柱后衍生法，柱前衍生法具有省时、仪器配置简单的优势。柱前衍生的关键在于衍生试剂的选择。 常用的衍生试剂有 邻苯二甲醛 ( 9 6 异硫氰酸苯酯(。 其中 是不能与二级氨基酸直接反应，需要用 同时与一级氨基酸和二级氨基酸反应 )来补充 ， 过多的 时它们的分离效 果不够理想； 过多的衍生剂会对测定结果产生干扰； 生效率较好，但是它为专利产品，应用成本较高； 相比之下 异硫氰酸苯酯（ 和氨基酸和亚氨基酸均能反应，反应的产物稳定 见图 1， 试剂的成本较低 ， 是目前氨基酸分析中具有吸引力的方法之一，因此本研究 采用 8种氨基 酸进行柱前衍生，液相色谱法进行测定。 N C S + H 2 N C H R C = 9 1 0N C H R C O 氨基酸和 五、 本标准分析条件的 优化 1 衍生反应条件的选择 应时间的确定 采用 氨基酸混 标工作 液， 将 衍生方法中的衍生时间设定为 10， 20， 30， 45， 60上述时间衍生，进样分析后，比较各氨基酸峰面积的变化 （ 以 ， 试验结果表明氨基酸在 45 60 图 2，因此本文选择 60 衍生剂的去除和介质 酸度 的调节 过量衍生试剂 色谱峰会有一定干扰， 去除 方法有真 空干燥和 有机溶剂 萃取，经过比较发现前者操作繁琐， 本方法 采用正己 烷 萃取 去除 到净化的目的 ；反应产物的介质为偏碱性介质，对色谱的峰形和重现性有一定的影响， 且该产物在中性介质较为稳定，因此本 方法 采用 加入 10%乙酸，将反应后的介质调节为中性。 2 色谱条件的选择 优化 谱分离条件的优化 18种氨基酸衍生物性质较为接近， 尤其是 同时黄酒中存在大量干扰物质， 如含量较高的氨根离子等也和 其 产物 与 此 ， 能 否有效的分离 18种氨基酸是 定量测定的重要因素 ；本研究首先选用不同 行 18种氨基酸的 测定 ，选择对 18种氨基酸分离效果好的色谱柱， 然后 开展流动相比例的选择 优化 ， 对流动相 温及离子对试剂的等因素进行了研究 ， 最终 采用梯度洗脱 的方式 ， 408种氨基酸 达到良好 分离 见图 3，图 4。 10 20 30 40 50 602004006008001000e a c ti o n ti m e (m i n )图 2 反应时间的影响 图 3 18种氨基酸标准溶液的色谱图 图 4 黄酒的 色谱图 流动相 流动相 基酸 分离度较大的 影响， 固定缓冲盐的浓度和三乙胺的 浓度 ， 配置 个不同 主要研究了对 5组较难分离 氨基酸 分离度 的影响， 由图 5可以看出 分离度 提高 ， 分离度 迅速 降低 ， 因此 本 研究 选择 1)(2)(3)(4)(5)图 5 流动相 基酸分离 的 影响（ 1） 2） 3） 4） （ 5） 3 标准曲线、 相关系数 及检出限 将 18种氨基酸混合标准液，稀释配置成 5个梯度混标， 以 紫外检测器 检测， 以峰面积 x（ )进行回归处理，计算线性回归方程。结果表明 ： 18种氨基酸的浓度在 时其浓度与峰面积呈良好的线性关系，相关系数 表 1 线性关系分析 及 相关系数 序号 氨基酸 线性方程 相关系数 检测限 (M) 1 y = 2862x+2269 R = 2 y = 2716x+33281 R = y = 2978 = y = 2889 = y = 2989 = y = 2680 = y = 2084x+14428 R = y = 3388x+72428 R = y = 3084x+12428 R = 0 y = 3469 = 1 y = 4446x+63483 R = 2 y = 4052x+43483 R = 3 y = 3692 = 4 y = 3642 = 5 y = 5575 = 6 y = 3859x+10343 R = 7 y = 3125 = 8 y = 8059x+464343 R = 样品加标回收率 在 黄酒 样品 中 加入 3种不同 浓度 氨基酸 标样后衍生 ， 根据氨基酸对照品的加入量计算回收率 ，测定结果见 表 2， 平均 回收率在 间 。 表 2 氨基酸的加标回收率 (n=3) 氨基酸 名称 黄酒加标（ 回收率（ % ） 平均回收率（ % ） 方法的精密度试验 （ 1） 将同一标样连续进样 8次，得到 18种氨基酸峰面积的 （ 2） 对同一黄酒样品平行衍生六次进行测定 ， 保留时间的 间， 峰面积 的 表 3， 说明 该方法 日内 测定结果重复性，精密度较高 。 表 3 方法重复性试验 氨基酸 保留时间 %） 峰面积 %） 氨基酸 保留时间 %） 峰面积 %） - ： 样品中未测定出 6 样品的稳定性试验 采用同一标品进行衍生后 ， 室温放置 8h ,24 h,36 h,48h,64相同的色谱条件下测定，进行 保留时间和峰面积 比较， 由表 4可以看出 保留时间 的 间 ， 峰面积 说明衍生物 具有较好的稳定性 。 表 4 氨基酸 衍生物稳定性试验 氨基酸 保留时间 %） 峰面积 %） 氨基酸 保留时间 %） 峰面积 %） 、本方法的验证结果 本方法经过 中国食品发酵工业研究院、上海金枫酒业股份有限公司、浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司等 6 家 实验室的进行了方法验证 ，黄酒样品稀释 10 倍后，加入不同浓度的 18 种氨基酸，制备了 1#， 2#， 3#， 4#， 5#对照样品， 验证结果见表 5，由表可见 实验室间的再现性相对标准偏差本小于 10% 。 表 5 6个实验室验证实验统计表 () 验证单位 # 2# 3# 4# 5# 1# 2# 3# 4# 5# 平均值 验证单位 # 2# 3# 4# 5# 1# 2# 3# 4# 5# 平均值 验证单位 # 2# 3# 4# 5# 1# 2# 3# 4# 5# 平均值 验证单位 # 2# 3# 4# 5# 1# 2# 3# 4# 5# 平均值 验证单位 # 2# 3# 4# 5# 1# 2# 3# 4# 5# - - - - - - - - - - - - - - - - - - 均值 验证单位 # 2# 3# 4# 5# 1# 2# 3# 4# 5# 平均值 验证单位 # 2# 3# 4# 5# 1# 2# 3# 4# 5# 平均值 验证单位 # 2# 3# 4# 5# 1# 2# 3# 4# 5# 平均值 验证单位 # 2# 3# 4# 5# 1# 2# 3# 4# 5# 平均值