杀菌率试验规程

.Q/KM ZJ 2008液体洗涤剂杀菌试验规程（内部使用）2008年月日内部执行质量管理中心实验室.引用标准1、 GB15979-2002一次性使用卫生用品卫生标准2、 QB/T2738-2005日化产品抗菌抑菌效果的评价方法3、 QB/T2850-2007抗菌抑菌型洗涤剂4、 2002 年版消毒技术规范(中华人民共和国卫生部)5、 2001 年版药品微生物学检验手册（科技出版社）杀菌率试验规程1、试验菌、试验温度、作用时间、试液浓度试验菌种：金黄色葡萄球菌（ATCC 6538），大肠杆菌（ 8099 或 ATCC 25922），白色念珠菌。 试验温度： 20 1。作用时间： 最短不得小于30s。常规作用时间为2min、5min、10min、 20min。 试液浓度： 中和剂鉴定用试液浓度应为正式杀菌试验最高浓度。菌悬液用量：正式 杀菌试验 用菌悬液的浓度、取量应与中和剂鉴定中1 组、 2 组所用 菌悬液的浓度、 取量相同。2、 细菌繁殖体悬液、菌片的制备程序：2.1 菌悬液的制备取冻干菌种管，在无菌操作下，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吸吹数次，使菌种融化分散。取含 5.0ml-10.0ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37培养 18h24h。用接种环取第1 代培养的菌悬液，划线于营养琼脂培养基平板上，于37培养18h24h。挑取上述第2 代培养物中典 型菌落，接种于营养琼脂斜面，于37培养 18h24h，即为第3 代培养物（放在4左右冰箱中保藏。 每隔 2-3 个月移种一次，继续保藏。 ）。取第3 代 14 代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（经18h 24h 培养），用5.0ml吸管吸取 3.0ml-5.0ml稀释液加入斜面试管内， 反复吹吸，洗下菌苔。随后，用5.0ml 吸管将洗液移至另一无菌 试管中，在手掌上振敲80 次（力度适中，勿溅出） ，以使细菌悬液均匀。或从新鲜菌种斜面沾取少量菌 苔，接种在适合试验菌生长的培养基中，37培养 18h 24h（或适宜时间）。作为原菌液。（源于药品 微生物学检验手册211 页）细菌繁殖体悬液应保存在4冰箱备用。 尽量减少在室温下放置时间，以减少细菌的自然死亡。应当 天使用不得过夜。44回收菌数为110 910cfu/ml用 PBS液配置GB15979-2002 一次性使用卫生用品卫生标准回收菌数为1 108 5 108cfu/ml 用 TSB营养肉汤配置 2002 消毒技术规范2.2 、菌片的制备程序：消毒技术规范取冻干菌种管，在无菌操作下，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吸吹数次，使菌种融化分散。取含 5.0ml-10.0ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37培养 18h24h。用接种环取第1 代培养的菌悬液，划线于营养琼脂培养基平板上，于37培养18h24h。挑取上述第2 代培养物中典 型菌落，接种于营养琼脂斜面，于37培养 18h24h，即为第3 代培养物。取第3 代 14 代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（经18h 24h 培养），用5.0ml吸管吸取3.0ml-5.0mlTSB营养肉汤 加入斜面试管内 ，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用5.0ml 吸管将洗液移至另一无菌试管中，在手掌上振敲80 次，以使细菌悬液均匀，含菌量1108 5 108cfu/ml 。用无菌镊子夹住已灭菌10mm*10mm滤纸一角，一面朝上，注入10ul菌悬液，放到无菌平板内，37 温箱中干燥20min-30min ，（或在室温自然阴干后使用）制成菌片。每个菌片回收菌落，按活菌培养计数 所得结果，应为5 105 5 106 cfu/片。）细菌繁殖体悬液和菌片，用毕应随时保存在4冰箱内。尽量减少在室温下放置时间，以减少细菌的 自然死亡。（应当天使用不得过夜。 ）3、操作程序3.1 、悬液定量法杀菌试验操作程序、 样品用无菌标准硬水稀释至同中和剂鉴定用试液浓度，或低于中和剂鉴定用试液浓度，制成（稀释 液）试验样液。、 将试管按需要数量分别排列于试管架上，各组由左向右，排序、标记。44、 配制菌悬液，浓度为1 10 910cfu/ml GB15979-2002一次性使用卫生用品卫生标准或18810 510 cfu/ml 2002 消毒技术规范、 取杀菌试验用无菌大试管，先加入0.5ml 试验用菌悬液，再加入0.5ml 有机干扰物质，混匀，置 201 5min ，用无菌吸管吸取步骤1 中的试验样液4.0ml 注入其中， 立即开启计时器， 并迅速混匀 （在 手掌上振摇80 次）。- 见消毒技术规范 或吸取试验用菌悬液0.1ml ，加入到含 5ml 样液的试管中，立 即开启计时器，并迅速混匀（在手掌上振摇80 次）。 - 见 QB/T 2738-2005、 作用 2min、5min、10min、20min，即刻用无菌吸管吸取0.5ml 移入鉴定合格的4.5ml 中和剂溶液 中（中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同）充分混匀，中和作用10min 后，取样液、 10 倍 系列稀释液0.5ml （见 GB15979-2002）或分别吸取1.0 ml（- 见消毒技术规范 ）（见图四），置于 2 个灭菌平皿，用凉至4045营养琼脂培养基或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15ml 作倾注，转动平皿， 使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板，35 2培养 48h（细菌）或（酵母菌）25 2培养 72h， 作活菌菌落计数。、 同时用稀释液代替样液进行平行试验，作为阳性对照管。、 阴性对照组：分别吸取试验用相关溶液和培养基进行培养，观察有无污染。、 计数菌落时，一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。以菌落数在 15cfu 300cfu 的平板为准，每 个稀释度 3 个平板生长菌落数全部合乎上述标准，则以该 3 个平板的菌落平均值作为结果；若有 2 个符 合合乎上述标准，则以该合格的 2 个平板菌落的平均值作为结果。、 试验重复3 次，求其平均值。根据各组活菌浓度（cfu/ml ），计算杀菌率，见计算公式1。或根据 各组活菌浓度换算为对数值（N），计算杀灭对数值，见计算公式2。3.2载体法杀菌试验操作程序、试验样品用无菌标准硬水（过滤除菌）稀释至规定浓度，制成（稀释液）试验样液。、吸取样液5.0ml 放入灭菌平皿，另吸取PBS 5.0ml 注入平皿中，作为阳性对照皿。每皿用无菌镊子 夹住菌片一角放入试样皿和阳性对照皿。、作用至设定时间后，即刻用无菌镊子夹住菌片一角，投入含5.0ml 中和剂的试管中（中和剂的浓度 与容量应与鉴定试验结果规定的相同）充分混匀计时。( 见图三 )、中和 10min 后，取样液或 10 倍系列稀释液 1.0ml （见图四），置于两个灭菌平皿，接种凉至 40 45营养琼脂培养基或沙氏琼脂培养基（酵母菌） 15ml，转动平皿 10-20 下，使其充分均匀，凝固 后，于 35 2培养 48h（细菌）或 72h（酵母菌），作活菌菌落计数。、试验重复3 次，求其平均值。、阴性对照组：分别吸取试验用相关溶液和培养基进行培养，观察有无污染。A、 PBC液（ 0.03mol/L磷酸盐缓冲液）、B、 无菌标准硬水1ml 置于灭菌平皿内、C、 空白平皿，倾注营养琼脂培养基（细菌）或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15ml 培养。、计数菌落时，一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。以菌落数在 15cfu 300cfu 的平板为准，每 个稀释度 3 个平板生长菌落数全部合乎上述标准，则以该 3 个平板的菌落平均值作为结果；若有 2 个符 合合乎上述标准，则以该合格的 2 个平板菌落的平均值作为结果。4、计算公式1、杀菌率 X1（ A B）/ A100% 式中： X1杀菌率（ %）；A- 对照样品平均菌落数；B- 被试样品平均菌落数。2、杀灭对数值（ KL）对照组平均活菌浓度的对数值（No）试验组活菌浓度的对数值（Nx） 备注：计算杀灭对数值时，取小数点后两位值，可以进行数字修约。如果消毒试验组消毒处理后平均生产菌落数，小于等于1 时，即大于等于试验前对照组平均活菌浓度的对数值。 5、评价标准杀菌率 90%，产品有杀菌作用。 悬液定量杀灭试验中，各次的杀灭对数值5.00 ，可判定为消毒合格。6、 操作要点：（消毒技术规范2002 版）1、对接触消毒剂（杀菌剂）的样本，在达到规定作用时间，即刻取样移入鉴定合格的中和剂 溶液中（中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同）；2、即刻混匀，并按规定时间吸取样液进行随后的培养检测；3、在将样本接种培养基以前的操作，应按规定时间内进行，以免微生物与中和剂或中和产物接触过久。审核：编制：中和剂悬液定量鉴定试验操作程序引用标准：QB/T2738-2005日化产品抗菌抑菌效果的评价方法（试验菌悬液在1 104 9 104cfu/ml ）4 9 104GB 15979-2002一次性使用卫生用品卫生标准（试验菌悬液在1 107 5107cfu/ml ）2002消毒技术规范（试验菌悬液在1 10一、定义和术语cfu/ml ）中和剂 在微生物杀灭试验中，试验微生物与杀菌剂作用达到规定时间的终点时，用以中和残留的杀菌剂，使其不在持续抑制和杀灭微生物的试剂。中和产物 中和剂加杀菌剂（样品）=9：1，作用 10min 配置而成。 二、 中和剂鉴定试验原理中和剂鉴定试验原理试验分组第 1 组杀菌剂 菌液培养第 2 组（杀菌剂 菌 液 ） 中和剂第 3 组中和剂 菌液培养第 4 组（杀菌剂 中 和剂） 菌液第 5 组阳性菌数对照第 6 组阴性对照。培养培养观察杀菌剂对观察残留杀菌观察中和剂是观察中和产阳性对照组。阴性对照组。试验菌有无杀剂被中和后，否抑菌。物，或未被完灭或抑制能力受到杀菌剂作全中和的残留试验目的用后的试验菌杀菌剂对试验是否能恢复生菌的生长繁殖长。是否有影响。三、 中和剂鉴定试验中易出现的问题及解决方法出现的问题解决方法1、组无菌生长或组平板上少于5 个菌落，其它组正常。降低消毒剂浓度或缩短作用时间。2菌落数较多且数量基本相同，其它组正常。提高消毒剂浓度或延长作用时间。3组中和剂菌落数明显少于PBS组菌数降低中和剂浓度或改变中和剂成分。4组（中和产物）菌落数明显少于PBS组菌数， 其它组正常。提高中和剂浓度或改变中和剂成分。5多次更换中和剂均不能得到满意结果。选用载体法进行中和剂鉴定，杀菌试验同时用载体法进行。四、 1 鉴定试验操作程序中和剂悬液定量鉴定试验操作程序- 消毒技术规范试验分组第 1 组第 2 组第 3 组第 4 组第 5 组第 6 组取试验样品4.0ml 加入各对应组取 4.5ml 中和剂 加 入 对 应 组取 4.9ml 中和产物 b 加 入对应组取 4.5mlPBS（稀释液）加 入对应组20 1恒温5min菌悬液1.0ml菌悬液1.0ml0.1ml 菌悬液 0.4ml 硬水 混匀0.1ml 菌悬液0.1ml 菌悬液 0.4ml 硬水 混匀振敲 80 次，混匀作用至试验预定时间，取 0.5ml 加入下列对应组作用 10min，取 0.5ml 加入下列各对应组PBS4.5ml中和剂4.5ml中和剂4.5ml中和产物4.5mlPBS4.5ml振敲 80 次、混匀/作用 10min/取适宜稀释度悬液 1.0ml接种平 板（ 2 个 / 样本）活菌培养计数活菌培养计数用中和剂10倍系列稀释用中和产物10 倍系列稀 释用稀释液 10倍系列稀释PBS中和剂各 1.0ml 接 种平板第 1 组不长第 2 组菌数第 3、4、5 组菌数相似，第 6 组无菌中和剂鉴定评价规定菌或明显少于第 2 组大于 5 且明显少于第 3、 4、 5 组误差率 15%生长三组间平均菌数 =（ 第 3+4+5 组菌数） 3； 误差率 %=（三组平均菌数 - 各组菌落平均数）中和剂鉴定合格标准中对1、 2 组菌数要求。05X（ 1-10 ）(X5) Y( 10) 1.5 Y的绝对值之和 /3 三组间平均菌数100符合上述评价的中和剂表明可消除试验样品对指示菌的作用，中和剂与试验样品的中结论和产物对指示菌无毒害，鉴定为该试验样品的中和剂。cfu/ml ）a 菌悬液浓度及制备：消毒技术规范用 PBS（试验菌悬液在1 107 5 107备注b 中和产物的配置：先将试验样液1.0ml 与中和剂溶液9ml 混合，作用10min 后制成四、 2 鉴定试验操作程序中和剂鉴定试验操作程序- 载体法试验分组用无菌镊子取 菌片加入下列第 1 组吸取试验 样品 5.0ml第 2 组吸取试验样品5.0ml 于无菌平第 3 组吸取中和剂5.0ml 于无菌第 4 组吸取中和产 物 5.0ml 于第 5 组吸取 PBS 5.0ml 于无菌第 6 组对应组于无菌平皿内平皿内无菌平皿内平皿内皿内作用至预定时间， 立即用无菌镊子取出菌片移入对应组混匀作用10min，立即用无菌镊子取出菌片移入对应组试管振打 80 次PBS5.0ml中和剂5.0ml中和剂5.0ml中和产物5.0ml稀释液5.0ml作用 10min作用 10min/取原液或稀释用稀释液用稀释液 10 倍用中和剂 10用中和产物用稀释液10稀释液液 1.0ml 接种平板（ 2 个/ 样10 倍系列稀释系列稀释倍系列稀释10 倍系列稀释倍系列稀释中和剂各 1.0ml本）接种平板操作要点即刻混匀，并按规定时间接种培养基中和剂鉴定评价第 1 组不第 2 组有且较第第 3、4、5 组菌数相似，且其误差率15%第 6 组无评价规定长菌或明显少于第 2组1 组为多，较第3、 4、 5 组为少 的菌数生长，并三组间平均菌数 =（第 3+4+5 组菌数）3；菌生长中和剂鉴定合 格标准中对1、 2 组菌数要求。符合下表要求。0 5X（1-10 ）(X 5) Y( 10)1.5 Y误差率 %=（三组平均菌数 - 各组菌落平均 数）的绝对值之和 /3 三组间平均菌数 100符合上述评价的中和剂表明可消除试验样品对指示菌的作用，中和剂与试验样品的中结论和产物对指示菌无毒害，鉴定为该试验样品的中和剂。a 菌悬液浓度及制备：用 PBS将指示菌制成1 104 9 104 cfu/ml悬液。（ -GB15979）cfu/ml ）备注消毒技术规范用 PBS（试验菌悬液在1 107 5107b 中和产物的配置：先将试验样液1.0ml 与中和剂溶液9ml 混合，作用10min 后制成四、 3 鉴定试验操作程序中和剂悬液定量鉴定试验操作程序- GB/T 15979 试验分组第 1 组第2 组第 3 组第 4 组第 5 组第 6 组取 0.10ml 菌悬取试验样品5.0ml加入各取 5.0ml 中和取 5.0ml 中取 5.0mlPBS液, 分别加入各组对应组剂 加 入 对 应组和产物 b 加入对应组（稀释液）加入对应组振敲 80 次，混匀作用至试验预定时间，取 0.5ml 加入下列对应组作用 10min，取 0.5ml 加入下列各对应组PBS4.5ml中和剂4.5ml中和剂4.5ml中和产物4.5mlPBS4.5ml振敲 80 次、混匀/作用 10min/取适宜稀释度悬液 1.0ml 接种平 板（ 2 个 / 样本）活菌培养计数活菌培养计数用中和剂10倍系列稀释用中和产物10 倍系列稀 释用稀释液 10倍系列稀释PBS中和剂各 1.0ml 接 种平板第 1 组不长第 2 组菌数第 3、4、5 组菌数相似，第 6 组无菌中和剂鉴定评价规定菌或明显少于第 2 组大于 5 且明显少于第 3、 4、 5 组误差率 15%生长三组间平均菌数 =（ 第 3+4+5 组菌数） 3； 误差率 %=（三组平均菌数 - 各组菌落平均数）中和剂鉴定合格标准中对1、 2 组菌数要求。05X（ 1-10 ）(X5) Y( 10) 1.5 Y的绝对值之和 /3 三组间平均菌数100符合上述评价的中和剂表明可消除试验样品对指示菌的作用，中和剂与试验样品的中结论和产物对指示菌无毒害，鉴定为该试验样品的中和剂。a 菌悬液浓度及制备：用 PBS将指示菌制成1 104 9 104 cfu/ml悬液。（ -GB15979）备注b 中和产物的配置：先将试验样液1.0ml 与中和剂溶液9ml 混合，作用10min 后制成七、消毒剂的常用中和剂的配置1、用于氯型杀菌剂（有效氯0.1-0.5% ）：硫代硫酸钠2、用于非氧化型杀菌剂：a：磷酸二氢钾1.36g 、磷酸氢二钠2.83g 、卵磷脂 10.0g 、甘氨酸 10.0g 、吐温 -80 30.0g 、蒸馏水1000mlb：磷酸二氢钾1.36g 、磷酸氢二钠2.83g 、卵磷脂 3.0g 、吐温 -80 20.0g、蒸馏水 1000ml 3、用于氧型杀菌剂：吐温-8020.0g、硫代硫酸钠10.0g 、 PBS1000m、l4、阳离子胍类消毒剂：卵磷脂3.0%、吐温 -80 3.0% 的 PBS溶液5、季胺盐类消毒剂（0.1-0.5% ）：吐温 -80 + 卵磷脂（ 1.0-2.0% ）6、酚类（ DP-300）消毒剂（ 3.0-5.0% ）：吐温 -80（0.5-3.0% ）7、复方消毒剂：吐温-80 + 卵磷脂 +硫代硫酸钠8、过氧乙酸（ 0.1-0.5% ）：硫代硫酸钠（ 0.1-1.0% ）9、过氧化氢（ 1.0-3.0% ）：硫代硫酸钠（ 0.5-1.0% ） 八、附悬液定量杀菌试验示意图、载体法试验杀菌率示意图审核：编制：质量管理中心谷爱军图一、细菌悬液+ 有机干扰物质 = 1 ： 1置 201 5min 后1ml1ml图二、阳性对照管注入样液 4ml注入稀释液4.0ml样液稀释液A作用至各预定时间后吸取 0.5ml 混合液加入4.5ml 经灭菌的中和剂中，充分混匀作用10min，培养。4.5ml4.5ml图三作用 10min0.5ml0.5ml中和剂0.5ml0.5ml图四1ml1ml4.5ml4.5ml中和剂4.5ml4.5mlAAAA-2-0-11ml1ml1ml1ml-0-2-1101010101010悬液定量杀菌试验示意图消毒技术规范图一、细菌悬液取 10ul 滴在 10mm10mm无菌滤纸上，干燥、制成菌片44（回收菌数为110 910（回收菌数为5105 5 106cfu/ 片-GB/T15979）cfu/ 片消毒技术规范）吸取样品稀释液5ml吸取 PBS5ml 作为阳性对照管放入一菌片放入一菌片作用至设定时间后，即刻用无菌镊子夹住菌片，投入各含5.0ml 中和剂的对应管中。