抗流感药物靶点及其抑制剂

.抗流感药物靶点及其抑制剂 流感病毒是一种负螺旋单链RNA病毒，属于正黏病毒科。根据病毒核蛋白（nucleoproteins，NP）及基质蛋白（matrix proteins，M1）的抗原决定簇不同，流感病毒被分为三类：甲型（A）、乙型（B）、丙型（C）。流感病毒颗粒结构大致相似（如图1），自内而外可分成核心、基质蛋白以及包膜三部分。病毒子通常呈圆形，长丝状。甲型和乙型流感病毒核酸有八个RNA节段，负责编码十种蛋白，包括血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）、酸性蛋白（PA）、碱性蛋白1（PB1）、PB2、核蛋白（NP）、基质蛋白（M1）、离子通道蛋白（M2）、非结构蛋白（NS1）、核输出蛋白（NEP或NS2）。此外，大多数甲型流感病毒还有线粒体靶向的寡聚PB1-F2蛋白1，报道其与细胞凋亡以及病毒毒力有关。这些病毒RNA片段同NP结合并缠绕形成病毒核糖核蛋白体（vRNP），vRNP再与三聚的RNA聚合酶（PA、PB1、PB2）结合形成核糖核苷酸，负责RNA的复制和转录，这种结合模式确保了病毒RNA对于核酸酶保持敏感。丙型流感病毒只有七个RNA节段。基因组分节段的特点为流感病毒高频率基因重配提供了条件。病毒核心被外部的脂蛋白膜包围，在脂膜上有基质蛋白M1，其是病毒颗粒的主要蛋白，并通过化学键结合到vRNP。M2蛋白为具有离子通道活性的跨膜蛋白。乙型流感病毒缺乏M2蛋白，但是一种叫做BM2的蛋白可以起到类似M2蛋白作用。病毒最外层的包膜是包裹基质蛋白的磷脂双分子层，该膜来源于宿主细胞的细胞膜。膜表面具有两类非常重要的“刺突”，即两种糖蛋白，HA和NA。乙型流感病毒表面抗原相对简单，仅有一种HA和一种NA。对于甲型流感，根据病毒表面抗原HA及NA的不同，其可进一步细分为16个HA亚型（H1 H16）、9个NA亚型(N1 N9)2。图1 甲型流感病毒结构模式图3三种类型流感病毒的宿主范围也是有区别的：甲型流感病毒能够感染哺乳类动物（人、猪、马等）和禽类，乙型流感病毒主要在人类和猪间传播，丙型流感病毒只在人类传播。另外，三种病毒的变异性及危害性从大到小依次是甲型、乙型、丙型，因此，对人类危害性最大的是甲型流感病毒。流感病毒感染及增殖过程图2 流感病毒感染及增殖机制4如图2所示，流感病毒感染及增殖过程可大致分为黏附内吞融合去包膜入核vRNA合成蛋白合成出核组装出芽释放等阶段。首先，流感病毒包膜表面抗原HA识别并粘附到宿主细胞膜表面糖脂或糖蛋白上的唾液酸（sialic acid，SA）受体上，在粘附阶段，神经氨酸酶的唾液酸酶活性阻止HA与气管上皮细胞粘液层唾液酸的结合，从而强化病毒感染。接着，在受体介导的细胞内吞作用下，结合于宿主细胞表面的病毒进入宿主细胞并形成胞内体（endosome）。胞内体内的低pH条件启动HA“融合域”构象转化，导致病毒包膜与胞内体膜发生融合。与此同时，非糖基化基质蛋白M2离子通道被激活，形成进入细胞内膜的内向质子流，引发基质蛋白M1与vRNP的解离。然后，vRNP被转运进入细胞核，启动病毒遗传信息的复制和转录。RdRP以及NP对流感病毒的转录和复制具有重要意义。新合成的NP以及RNA聚合酶也被转入细胞核，与新和成的vRNA结合形成子代vRNP。在非结构性的核输出蛋白NEP/NS2及基质蛋白M1介导下，核内形成的子代vRNP被转运出宿主细胞核进入细胞浆，经装配形成成熟病毒颗粒。出芽后的新病毒颗粒仍然通过HA-SA键吸附于宿主细胞表面，经NA水解SA释放子代病毒，造成病毒的扩散与传播5。抗流感病毒靶点及其抑制剂预防和治疗流感，通常采用疫苗和抗流感化学药物。流感病毒不断地变异，常规疫苗可能难以预防治疗新病毒引发的流感大爆发，因此，抗流感化学药物研究具有非常重要的意义。总的来说，目前的抗流感化学药物有两个大的研究方向，分别针对流感病毒本身功能蛋白和宿主细胞潜在靶点。基于宿主的抗流感病毒靶标及抑制剂基于宿主的抗流感病毒靶标包括蛋白酶和囊泡质子ATP酶以及激酶等，然而这类药物对于非感染组织的潜在毒性还有待评价。（1）蛋白酶 前体蛋白HA0剪切位点的性质决定了能够剪切HA0的宿主蛋白酶类型，直接影响病毒嗜组织性和致病力。在高致病性H5和H7禽流感病毒中，HA0剪切位点含有多碱基序列，可被宿主细胞内广泛存在的碱性氨基酸蛋白酶或者PC6蛋白酶剪切，引起鸟类致死性的全身感染6, 7。然而，在一般的甲型流感病毒中，蛋白酶剪切位点表达的是单个精氨酸残基，只能被内蛋白酶识别，同时这种蛋白酶仅在鸟类肠道以及鸟类与哺乳动物的呼吸道中表达，极大地限制病毒在宿主体内的传播8, 9。事实上，如图3所示，已知的蛋白酶抑制剂，包括萘莫司他（Nafamostat）、卡莫司他（Camostat）等，均对甲、乙型流感病毒表现出较好的体内外选择性抑制作用5。图3 蛋白酶及V-ATPase抑制剂（2）囊泡质子ATP酶（V-ATPase） 选择性V-ATPase抑制剂通过升高前溶酶体内部pH，从而抑制HA从非融合构象向融合构象的转化，进而实现病毒复制的抑制。针对该靶点的化合物有1994年报道的Norakin（如图3）。针对流感病毒自身功能蛋白的靶点及抑制剂该类化学药物根据病毒作用部位不同，可分为三大类，分别针对病毒核心（RdRP、NP）、病毒基质蛋白（M2）、病毒包膜突触（HA、NA），下面就它们的抑制剂作简单介绍。（1）RdRP 流感病毒RdRP进化中高度保守，与哺乳动物的RNA聚合酶完全不同，流感病毒RdRP同时具有复制酶和核酸内切酶活性。感染早期阶段，RdRP以vRNA为模板合成mRNA，具有转录功能；病毒感染晚期，RdRP构象转变，以vRNA为模板合成互补的cRNA，再以合成的cRNA为模板合成vRNA,从而实现复制功能。RdRP由异三聚的PA、PB1、PB2三个亚基构成，也称为3P复合体。PB1位于3P复合体的核心，其N端和C端分别与PA亚基的C端、PB2亚基N端相连，形成稳定蛋白复合物。PB1亚基通过不同构象结合vRNA或cRNA，分别合成mRNA（或cRNA）、vRNA，从而履行转录、复制功能。其构象的转换也是PB2帽子结合位点与内切酶活性位点激活的一个原因10。如图4所示，化合物A是近年报道的靶向PB1的化合物，其IC50值为0.5 M11。PB2亚基具有多重功能。首先，PB2亚基318-483位氨基酸残基区域能够与宿主mRNA引物帽结构结合12，从而启动转录过程。其次，PB2亚基C端678-757位氨基酸残基区域存在二重核定位信号（NSL），与RNA聚合酶通过核孔转运至细胞核内有关。第三，PB2亚基能够增强聚合酶复合物的稳定性，这可能是PB2亚基能够增强流感病毒对外界温度适应性的原因13。最后，研究发现PB2亚基R702、K627分别与病毒宿主选择性14、致病性15有密切关系。如图4所示，化合物B为近年报道的靶向PB2的化合物，其抑制A/H3N2的IC50为7.5 M16。图4 RdRP的抑制剂PA也是3P复合体一个非常重要的亚基。Yuan17和Dias18分别在Mg2+、Mn2+存在下，获得了PA亚基N末端的晶体结构，验证了PA亚基内存在核酸内切酶活性位点，也表明该核酸内切酶具有双离子介导的作用机制。其次，PA亚基为磷酸化蛋白，1247位氨基酸残基区域是其介导蛋白质水解的功能区，其水解活性与聚合酶活性呈正相关19。再者，PA亚基也能够与vRNA、cRNA启动子特异性结合，163178位氨基酸的突变，导致PA亚基与cRNA结合力降低，聚合酶活性的抑制20。另外，PA亚基124139及186247两个氨基酸残基区域存在两个核定位（NSL）信号，这与PB1亚基穿核运输及核内聚集相关21。2008年，通过共沉淀结晶的方法，He等22获得了H5N1亚型AIV的PAC-PB1N蛋白复合物的晶体结构，由于二者相互作用的残基在甲型流感中高度保守，这为新一代抗流感药物的设计提供了新靶标。2012年，Muratore23通过虚拟筛选发现图 4所示化合物C，其可以干扰PA、PB1蛋白正确结合，其抑制病毒斑形成的ED50为20 M左右。2013年，Massari24报道了化合物D，也是PAC-PB1N相互作用抑制剂，结构如图 4所示，其对A/H1N1亚型AIV的EC50一般为20 M。2014年，Pagano25报道了两个化合物（如图 4所示化合物E、F），其抑制A/H1N1亚型AIV的IC50均为1 M。利巴韦林（Ribavirin）和Favipiravir（T-705）是两个核苷类的RdRP抑制剂（图 4），IC50值分别为6.837 M、1 M。前者很早就已上市，是一种广谱抗病毒药物，后者目前处于临床期（日本）。T-705是一种前药，代谢活化后，通过竞争性结合GTP抑制流感病毒RdRP。与Ribavirin比较，其不影响宿主DNA/RNA的合成，仅轻度抑制宿主次黄嘌呤核苷酸脱氢酶，高剂量下无显著细胞毒性，安全性更高。同时，T-705对NAI、M2I耐药病毒株也有效26。因此，T-705是一个具有很大市场潜力的药物。（2）NP 核蛋白占病毒蛋白总量的30，其N端含有一个RNA结合区域以及两个核蛋白-核蛋白相互作用区域。NP作为结构蛋白组成vRNP，与病毒宿主的特异性也有关，同时，参与病毒复制的多个阶段，包括：在双重核定位信号作用下，vRNP进入宿主细胞核过程；vRNA在宿主细胞核内的合成；通过与PB1和PB2的相互作用对多聚酶活性的调节；通过与M1/NS2相互作用对vRNP出核的调控。NP含有一种胞浆聚集信号，通过与丝状肌动蛋白相互作用，导致NP在病毒感染后期滞留在胞浆。2006年，Ye等27完成了对A/WSN/33流感病毒NP晶体结构的解析，揭示了NP尾环介导的NP聚合。不同亚型的A型流感病毒尾环的组成氨基酸进化中高度保守，其上30个氨基酸残基的单个突变就可导致NP聚合能力的完全丧失，因此，尾环上的结合口袋成为NP靶向抗流感药物的潜在靶点。2006年，香港大学袁国勇课题组28发现了名为nucleozin的小分子化合物，其靶向NP聚集,阻断NP转运入核,从而抑制H1N1、H3N2、H5N1亚型AIV的感染，证实了NP可作为抗流感靶点。2012年，丁克课题组29通过对nucleozin的改构，发现了化合物G（如图5），其针对各种H3N2、H1N1的IC50值的范围为0.54.6 M，对金刚烷胺耐药的A/WSN/33(H1N1)、奥司他韦耐药的A/WSN/1933(H1N1,274Y)病毒株也有一定效果。该类化合物结构如图 5所示。图 5 NP及HA的抑制剂（3）M2 金刚烷胺、金刚乙胺为两个最具代表性的M2离子通道抑制剂，仅对甲型流感有效。这两个药物在临床上使用多年，耐药性问题突出。但是，这类药物能够促进外呼吸道扩张从而增加摄氧量，使得其在抗流感中仍然具有重要价值。耐药毒株氨基酸突变区结构的进一步阐明，为该类药物解决耐药问题提供了机遇30, 31。同时，针对A/M2及BM2蛋白进化高度保守区HXXXW开发抑制剂，有望得到对甲型、乙型流感均有效的药物32。（4）HA 流感病毒进入靶细胞的过程需要酸性环境的诱导：在胞内体低pH条件下，HA构象改变，前体蛋白HA0经蛋白酶剪切形成HA1和HA2，暴露出隐藏在蛋白中的融合域，即HA2的疏水N端。HA2的N端插入胞内体膜，每三分子的HA2即形成六螺旋束形“融合孔”，使得病毒膜与胞内体膜融合，病毒基因组通过融合孔进入细胞质。而HAl负责与宿主细胞膜表面的唾液酸受体结合，介导病毒通过胞饮方式进入细胞形成胞内体。靶向HA的抗流感化合物，根据机制不同可分为两类：一类是阻止HAl与宿主细胞膜表面SA受体结合的黏附抑制剂，这类以fludase（DAS181）为代表，其是一种新型唾液酸酶融合蛋白，目前处于b期临床（美国）；另一类是阻断HA2介导的膜融合过程的融合抑制剂（抑制低pH诱导的HA构象转化），这是人们研究较早的一类抑制剂，包括1997年报道的以BMY-27709为代表的水杨酰胺类、1998年报道的以stachyflin为代表的司他弗林类化合物。该类化合物结构如图 5所示。（5）NA 1967年，一种神经氨酸酶类似物（DANA）被Meindl等合成，然而，其对NA的抑制活性并不显著，未能应用于抗流感治疗。1993年，伴随着神经氨酸酶晶体结构的解析33，von Itzstein34等对DANA进行了结构改造，除了环上取代基手性的调整，将DANA母核的4位羟基用碱性的胍基替代，得到了第一个临床使用的NAI扎那米韦（zanamivir），其对NA的亲和力较DANA高100倍。但是，其口服生物利用度低，目前临床主要使用其吸入剂型。1997年，Kim等35用环己烯环替换扎那米韦的吡喃环，保证环上取代基空间伸展方向不变情况下，用疏水的3-戊氧基替代扎那米韦母环6位上连接的甘油基，将强碱性胍基用氨基替代，得到了奥司他韦（Oseltamivir）。该化合物于1999年被FDA批准用于临床。其能有效抑制流感病毒，同时，相对于扎那米韦，其口服生物利用度大大提升，固体口服给药途经增加了患者的依从性，是目前使用最广的NAI35,这也导致了其耐药性积累速度最快。目前临床使用较少的NAI还有在日本应用的帕拉米韦（Peramivir）以及拉尼那米韦（Laninamivir），其中拉尼那米韦属于目前唯一长效NAI。对于奥司他韦耐受，又不能喷雾吸入扎那米韦的患者，可以考虑静脉注射帕拉米韦；现有研究表明对于奥司他韦耐药的毒株，拉尼那米韦依然有效，同时拉尼那米韦一天只需服用一次，使得患者依从性更好36。目前，从人、猪、禽类中分离的NAI耐药病毒株，包括了除N4亚型之外所有甲型流感病毒亚型以及乙型流感病毒。在流行的高致病性N1亚型（如H1N1、H5N1等）中，奥司他韦耐受问题最普遍，H274Y突变是导致其耐受的主要原因37。常见的N2亚型（主要为H3N2）耐药突变为E119V、R292K突变，但是H274Y突变并不能导致N2亚型对奥司他韦的耐药37, 38。乙型流感病毒对扎那米韦的耐药与R152K突变有关39，对奥司他韦的耐药与R317K突变相关40。图 6列出了奥司他韦与NA催化区（以N8为例）结合模式，我们将结合区分为4个亚位点。2002年，Hanessian41将奥司他韦母环5位氨基用乙烯基取代，成功得到了化合物H（Ki = 45 nM，本节所有讨论的NAI结构见图 8），探讨了NA催化区2号亚位点发生疏水相互作用而非电荷相互作用的可能性。2012年，Bhatt42继续对该位点改造，通过羟基、甲氧基、乙氧基、烯丙基取代的对比，发现还是羟基取代（化合物I）的活性最高(IC50 = 0.32 M)。通过Hanessian和Bhatt的工作，我们发现NA催化区2号亚位点的氢键相互作用对于NAI的活性非常重要。图 6 奥司他韦与N8催化区结合模式图在系统分类中，甲型流感病毒NA可分为两大类，类（Group 1）包括N1、N4、N5、N8四种亚型，类（Group 2）包括N2、N3、N6、N7、N9五种亚型。2006年，随着Russell43等对N1、N4、N8的结构解析，人们发现：类NA催化区2号亚位点附近连接着开放的“150腔”；然而，类NA中“150-LOOP”处于封闭构象，使得类NA活性结合区旁边不存在该“150腔”，如图 7所示。“150腔”的发现为设计选择性的类NA抑制剂、解决病毒耐药问题提供了新思路。Pinto课题组44以奥司他韦为先导化合物，用带羟基侧链的三氮唑替换奥司他韦骨架5位上的氨基，得到了以化合物J为代表的类选择性的NAI（Ki = 1.510-9 4.610-10 M）。2013年，Kerry 45通过化合物的共晶体结构，验证了化合物J同时占据NA催化区和“150腔”，是一种双位点抑制剂。2014年，在对奥司他韦母环5位氨基进行异硫脲取代时，Pinto课题组意外得到了螺环化合物K（如图 8），其对HK1流感病毒的有效浓度为10-610-7 M。N8与化合物K的共结晶结构表明，化合物上螺环在催化区偏向150-LOOP，有利于“150腔”的形成，这为开发双位点抑制剂提供了一种思路46。图 744 A.奥司他韦与N1结合模式；B.奥司他韦与N9结合模式为了克服不利的药动学性质引发的耐药问题，Schade47也对奥司他韦母环5位氨基的取代进行了探讨。利用生物电子等排体和前药的设计原理，成功得到了药动学性质和口服生物利用度比较理想，同时对奥司他韦耐药的H1N1突变株有效的化合物L，其活化代谢物抗H1N1的IC50 = 14.5 nM。除了对奥司他韦母环5位氨基的结构改造，Cheng48用磷酸基和磷酸酯将母环1位上羧基替换，成功得到了化合物M，其能够在纳摩水平甚至皮摩水平抑制多种流感病毒复制，包括H274Y耐药毒株。开发抗流感病毒不可逆抑制剂也是解决当前耐药问题的一种思路。2013年，Kim49通过对神经氨酸酶催化过渡态的研究，设计合成了以化合物N为代表的一系列，-二氟取代的化合物。这些化合物能够与神经氨酸酶催化区Tyr406形成短暂的共价中间体，广谱强效抑制流感病毒，包括扎那米韦和奥司他韦耐药毒株。在动物实验中，药效与上市药物相当或者优于上市药物。图 8 上市及最新报道的NAI总的来说，对于NAI日益严重的耐药问题，人们将大量关注集中于奥司他韦母核5位上的氨基的改构，母核1位羧基改构及不可逆抑制剂设计也有零星的探讨；NA催化区2号亚位点旁边“150腔”的发现与结构解析，也为人们解决NAI的耐药问题提供了新思路。参考文献1 Chanturiya A.N., Basanez G., Schubert U., et al. 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