免疫球蛋白医学详情.ppt

1,免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）,魔天记,2,免疫球蛋白的发现及定义第一节免疫球蛋白的结构第二节免疫球蛋白的异质性第三节免疫球蛋白的功能第四节各类免疫球蛋白的特性与功能第五节穿膜型和分泌型Ig第六节人工制备抗体,本章内容,3,免疫学是研究宿主免疫系统识别并消除有害生物及其成分的应答过程及机制的科学。,什么是免疫学？,4,免疫学经历了四个迅速发展阶段,1876年后，多种病原菌被发现，用已灭活及减毒的病原体制成疫苗，预防多种传染病，使疫苗得以广泛发展和使用。1900年前后，抗原与抗体的发现，揭示出“抗原诱导特异抗体产生”这一免疫学的根本问题，促进了免疫化学的发展及抗体的临床应用。1957年后，细胞免疫学的兴起，特异免疫是T及B淋巴细胞对抗原刺激所进行的主动免疫应答过程的结果。1977年后，分子免疫学的发展，得以从基因活化的分子水平，理解抗原刺激与淋巴细胞应答类型的内在联系与机制。,5,抗体的发现,1890年德国学者Behring和日本学者Kitasato用白喉杆菌外毒素免疫动物，在其血清中发现一种能中和这种外毒素的组分称为抗毒素。这是在血清中发现的第一种抗体：白喉抗毒素。1891年应用来自动物的免疫血清成功地治疗了白喉患者，是第一个被动免疫治疗的病例，从此挽救了成千上万的白喉患儿。Behring于1901年获得了第一届诺贝尔医学奖。,6,与抗体有关的诺贝尔奖获得者,7,JohnB.Gurdon，1933年出生于英国的Dippenhall。1960年从牛津大学获得博士学位，曾在加州理工学院做博士后，于1972年加入剑桥大学，成为细胞生物学教授。目前他供职于剑桥Gurdon研究所。ShinyaYamanaka，1962年出生于日本大阪。1987年从神户大学获得MD。在转向基础研究之前，他曾受训为整形外科医生。1993年他从大阪市立大学获得博士学位，之后他曾供职于美国旧金山Gladstone研究所和日本奈良先端科学技术大学院大学。目前他于日本京都大学担任教授。,2012年诺贝尔生理学或医学奖,发现成熟细胞可被重编程变为多能性,英国科学家约翰戈登（JohnB.Gurdon）日本科学家山中伸弥（ShinyaYamanaka）,8,免疫球蛋白与抗体,免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）：具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。抗体（antibody，Ab)：机体在抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。主要存在于血清-球蛋白组分中，分布于体液（血液、淋巴液、组织液及外分泌液）中，主要存在于血清中。,9,抗体与免疫球蛋白的发现（1937TiseliusandKabat）,Immunesera,Normalsera,血清蛋白电泳,血清蛋白根据电泳可分为：白蛋白、球蛋白；抗体分布在、球蛋白的区域，但主要分布在球蛋白区域,10,免疫球蛋白与抗体,Ab和Ig的关系：抗体并不都在区，区的球蛋白也不一定都具有抗体活性。1964年，世界卫生组织（WHO）将具有抗体活性以及与抗体相关的球蛋白统称为免疫球蛋白(Ig)。所有抗体都是免疫球蛋白，并非所有免疫球蛋白都具有抗体活性。现代免疫学认为，抗体与免疫球蛋白是等同的概念；只是抗体侧重于其生物学活性的描述，而免疫球蛋白侧重强调其化学结构。,11,分泌型(secretedIg,Sig，血清型抗体)：存在血液和组织中，具有抗体各种免疫功能，由浆细胞产生。膜型(membraneIg,mIg)：B淋巴细胞表面的抗原识别受体，是由成熟B细胞产生的膜表面免疫球蛋白。,免疫球蛋白分类：,12,第一节免疫球蛋白的结构（Igstructure）,13,一、免疫球蛋白的基本结构（basicstructure）,14,重链与轻链可变区与恒定区高可变区（互补决定区）与框架区免疫球蛋白折叠（功能域）绞链区,免疫球蛋白的基本结构,15,两条重链和两条轻链链间二硫键连接，呈“Y”型上部为N端(氨基端）下部为C端(羧基端）,四肽链结构,16,轻链（L链）214aa（25kDa）有两个由链内二硫键组成的环肽。分类：kappa()和lambda()2个亚型正常人:2：1；小鼠:20:1，和的比例异常可能反映免疫系统的异常。,（一）轻链和重链,17,（一）轻链和重链,重链（H链）450550aa（50-75kDa)4-5个链内二硫键分为5类：、链与轻链的链或链组成完整的Ig分子：,18,（二）可变区和恒定区,通过对H链或L链的氨基酸序列比较分析，发现：N-末端序列变化很大，称此区为可变区（V区）C-末端氨基酸相对稳定，变化很小，称此区为恒定区（C区）,19,多肽链的N端，轻链的1/2与重链的1/4氨基酸种类、排列顺序差异较大，构成抗体的多样性,可变区(Variabledomain,V区),20,高变区(hypervariableregion，HVR)或互补决定区(complementaritydeterminingregion,CDR)：氨基酸组成和排列顺序高度可变。VL有3个HVR，VH有3个HVR，分别称为VL和VH的HVR1,2,3(CDR1,2,3)，三个高变区共同组成Ig的抗原结合部位。,可变区,21,骨架区(frameworkregion,FR):CDR之外V区的氨基酸组成和排列顺序变化较小。,可变区,22,多肽链的C端，轻链1/2(CL),重链3/4(CH1,CH2,CH3)同一种属个体，产生针对不同抗原的同一类别Ig，C区氨基酸组成和排列顺序恒定，是制备第二抗体进行标记的基础重链恒定区氨基酸组成及排列顺序不同，抗体分为5种：,恒定区(constantregion,C区）,23,（三）结构域（domain）,L链：VL区CL区H链：VH区CH1区CH2区CH3区(IgG、IgA、IgD)CH4区(IgM,IgE),Ig的H链、L链每隔110个氨基酸残基序列即由链内二硫键连接折叠形成一个能行使特定功能的球性单位，又叫功能区（domain）。,24,V区,VL+VH功能区：抗原结合部位,CH3功能区：与Fc受体结合的部位,CL和CH1区：同种异型抗体的遗传标记。,CH2区：IgG的CH2和IgM的CH3具有补体C1q结合位点；IgG借助CH2可通过胎盘,免疫球蛋白各结构域的主要功能：,C区,25,功能区的二级结构是由3-5股反向平行的折叠股各自形成两个片层，每个折叠股由5-10个氨基酸残基组成，二硫键垂直连接两个片层，形成球形结构，肽链的这种折叠方式称为Ig折叠。,(1)免疫球蛋白折叠(Igfolding）,26,Ig可变区的晶体结构显示，两个片层形成了可变区的骨架，为可变区提供了结构框架。高变区在每个片层的边缘形成了三个环状结构，可变区序列的变化主要集中在这些环状部位。,27,有着与Ig功能域同源功能域的其他分子,包括MHCI和II类分子,T细胞受体,CD2,CD3,CD4,CD8,ICAMs,VCAM和某些Fc受体。,(2)Igsupergenefamily(IgSF)(Ig超基因家族),28,铰链区不是一个独立的功能区，位于CH1和CH2之间，包括链间二硫键，富含脯氨酸，具有柔曲性，可以伸展、弯曲和转动，有利于与不同距离的抗原表位结合，有利于暴露抗体分子的补体结合点。,(四）铰链区（hingeregion）,29,(四）铰链区,IgG3和IgD:长IgG1,2,4,IgA:短;IgM和IgE:无,30,当Ab与Ag结合时，铰链区发生扭曲，使Ab的2个抗原结合点更好地与2个抗原决定簇互补。,(四）铰链区,含有木瓜蛋白酶、胃蛋白酶的水解位点。意义：阐明Ig分子生物学作用；构建基因工程抗体。,31,1木瓜蛋白酶的水解片段,裂解部位：铰链区近N端裂解片段：2Fab+FcFab(fragmentofantigen-binding,抗原结合片段)：结合价为单价，只能结合一个抗原决定簇，故不能连接成较大的抗原抗体复合物，不出现凝集或沉淀现象。Fc(fragmentcrystalizable,可结晶片段):在低温或低离子强度下可形成结晶。不含抗原结合活性。Ig在异种间免疫所具有的抗原性主要存在于Fc段，同时Fc段还具有活化补体、通过胎盘和介导与细菌蛋白结合等生物学活性。,（五）酶解片段,32,（五）酶解片段,裂解部位：铰链C区端裂解片段：F(ab)2+pFcF(ab)2：结合抗原为双价,可出现凝集作用和免疫沉癜。由于F(ab)2保持了结合相应抗原的生物学活性，又减少了Fc段抗原性可能引起的副作用，因而在生物制品中有实际应用价值；因缺乏Fc部分，故不具备固定补体及与细胞膜表面Fc受体结合的功能。pFc：Fc碎片，不再具有任何生物学活性。,2胃蛋白酶的水解片段,33,二、免疫球蛋白的其它成分,34,Ig的其它成分,1.连接链（joiningchain，J链)(1)化学本质：浆细胞分泌的富含半胱氨酸的多肽链，以二硫键的形式结合到Ig重链羧基端。(2)存在：IgM（五聚体）,sIgA（双体）.IgD和IgE常为单体，不含J链。(3)主要功能：连接单体Ig分子使其成为多聚体，可能与保持已形成的多聚体的稳定性有关.,2.分泌片（secretorycomponent，分泌小体,分泌成分）(1)化学本质:由粘膜上皮细胞合成的一种多肽，存在于各种外分泌液（如泪液、胆汁、初乳）中，以共价形式与分泌型多聚Ig（IgA或较少见于IgM）形成复合物，介导其向粘膜上皮外主动输送，故又称为多聚免疫球蛋白受体（polymericIgreceptor，pIgR）。(2)作用：帮助IgA穿越黏膜;保护sIgA的铰链区免受蛋白水解酶降解的作用，增强了黏附作用及防御能力，具有抗炎和抗感染的特征.,J链,35,IgA双体由浆细胞分泌后，与粘膜上皮细胞基底侧表面的pIgR结合。在酶的作用下，pIgR于跨膜区与胞外区之间断开，形成带有分泌片的SIgA,被细胞吞饮并被转运至粘膜表面或分泌物中。在穿越粘膜上皮的过程中，IgA也许会与侵入细胞的相应抗原结合，把病原体或其产物从胞内带出到粘膜腔，从而避免对粘膜上皮细胞的伤害。pIgR与IgA结合，增加了IgA对外分泌液中蛋白水解酶的抵抗。如上皮细胞不能合成pIgR，会导致外分泌液中缺乏SIgA，患者胃肠道感染后长时间腹泻。,sIgA的转运过程,36,IgA不能通过胎盘，新生儿血清中无IgA抗体。母乳中的分泌型IgA含量最多，可输送到新生儿的消化管道黏膜中，对新生儿是最为重要的一类抗体。新生儿出生46个月后，血中可出现IgA，以后逐渐升高，到青少年期达到高峰。,37,第二节免疫球蛋白的异质性,38,抗体的异质性,抗体的异质性即免疫球蛋白的不均一性免疫球蛋白的类型：类、亚类、型、亚型Ig的血清型-内源性因素，抗原性Ig的多样性-外源性因素，抗体性,39,免疫球蛋白既可与相应的抗原发生特异性结合，其本身也是抗原，又可激发机体B细胞分泌抗Ig的抗体，产生特异性免疫应答。结构基础是在免疫球蛋白分子中包含有多种不同的抗原表位，呈现出不同的免疫原性。据抗体的抗原决定簇存在部位及在异种同体或自体中产生免疫反应的差别，抗体的抗原性分为:,（一）内源因素所致的异质性Ig血清型（免疫原性）,同种型同种异型独特型,40,同种型(Isotype):同一种属所有正常个体共有的Ig的抗原特异性标记，即同种型抗原存在种属差异，在异种体内可诱导产生相应的抗体。为种属型标志，存在于Ig的C区，包括CH和CL，同种型包括Ig的H链的类、亚类和L链的型和亚型。,41,免疫球蛋白的类型：,类（class）：在同一种属的所有个体内，Ig重链C区（CH）所含抗原表位不同（即氨基酸组成、排列、空间构型、二硫键数目等），将重链分为、链五种，与L链组成完整的分子，即IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。,42,亚类（subclass）：同一类Ig重链的抗原性（氨基酸的组成和序列）及二硫键数目和位置不同（铰链区），可将Ig分为亚类。IgG有IgG1IgG4；IgA有IgA1和IgA2。,43,型（type)：在同一种属所有个体内，根据Ig轻链C区(CL)所含抗原表位的不同，分为两种：和，与此对应的Ig蛋白分为和两型亚型（subtype）：按轻链恒定区（C2）个别氨基酸的差异又可分为1,2,3,4四个亚型。,OZ(+)(或1)：第190位(亮氨酸)OZ(-)(或2)：第190位(精氨酸)Kern(+)(或3)：第154位(甘氨酸)Kern(-)(或4)：第154位(丝氨酸),44,同一种属但不同个体间的Ig分子免疫原性的不同，也可刺激同种异体间产生特异性免疫应答。它存在于Ig的C区一个或数个氨基酸的差异，可能是编码Ig的结构基因发生点突变被稳定地遗传下来，可作为遗传标记。,同种异型(Allotype):,45,同一种属、同一个体来源的抗体分子，由于不同B细胞克隆产生的IgV区尤其是CDR区的氨基酸组成、排列和构型的不同，可显示不同的免疫原性，是每个Ig分子所特有的抗原特异性标志，其表位又称独特位。抗体分子每个Fab片段均存在56个独特位。单一个体数量大，108以上。,独特型（Idiotype):,46,免疫球蛋白血清型,血清型分布类别变异部位,同种型同种内所有正常个体类（IgG、IgA、IgM、IgD、IgE)CH,亚类（IgG1-4、IgA1-2）CH,型和亚型CL、CL(),同种异型同种内不同个体Gm1-Gm30、A2m1-A2m2CH、CL,独特型单细胞克隆产生的Ig极多，108CDR,（1）IgG的同种异型以Gm表示，G表示链，m代表标记(marker)。（2）IgA同种异型以Am表示，2链上的同种异型2H链已发现有A2m1和A2m2两种。1H链上尚未发现有同种异型存在。,47,（二）外源性因素所致的异质性Ig的多样性,不同抗原表位刺激机体产生特异性不同的抗体。同一抗原表位诱生的抗体，其识别抗原的特异性相同，但由于重链和轻链的类型不同，可产生不同类别和型别的抗体。体内所产生的抗体是异质性抗体的总和，包含针对各种抗原表位的不同特异性抗体以及对同一表位的不同类型抗体。,48,第三节免疫球蛋白的功能FunctionofIg,一、特异性结合抗原二、激活补体三、结合FC段受体四、通过胎盘和粘膜,49,50,抗原结合于抗体的抗原结合位点的凹处或沟中或展开的表面,（一）IgV区的功能：识别并特异性结合抗原；中和病毒或毒素，产生凝集和沉淀，有利于吞噬。,疫苗,51,抗原与抗体结合的力：,静电引力（electrostaticforces）氢键:最具特异性（hydrogenbond）范德华引力:作用最小距离近（vanderWaalsinteractions）疏水作用力:作用最大距离近（hydrophobicinteractions）,非共价键：,52,抗体分子上一个抗原结合点（Fab段）与对应的抗原决定簇之间相适应而存在着的引力，是抗原抗体间固有的结合力,亲和力(affinity),抗原抗体的亲和力和亲合力,抗体结合抗原的亲和力是两者之间吸引力和排斥力的总和。高亲和力抗体意味着吻合良好，低亲和力抗体吻合不佳。,53,抗体结合部位与抗原表位之间结合的强度，整个抗体分子与抗原物质之间的结合强度。,亲合力(avidity),抗原抗体亲合力示意图,54,亲合力与抗体结合价直接相关。即所谓多价优势，如IgG为2价，亲合力为单价的103倍，IgM为5-10价，亲合力为单价的107倍。,55,（二）C区的功能,1.激活补体（activationofcomplement）利用补体的溶细胞（细胞毒）效应溶解抗原靶细胞（IgM:CH3,IgG:CH2）,56,MAC(membraneattackcomplex)膜攻击复合体,PentamericIgM:五聚体IgMStapleform:订书钉形式的IgM,激活补体,57,只有与抗原形成复合物的抗体才能激活补体,58,2.与细胞表面的Fc受体结合（CombiningFcreceptoroncellsurface）,(1)生理作用:诱导细胞功能,59,(2)抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(Antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC),60,NK细胞的ADCC作用,Granzyme:颗粒酶,61,Macrophages的ADCC作用,62,(3)抗体介导的调理吞噬作用（Opsonization）,Lysosome溶酶体Phagosome吞噬小体Phagolysosome吞噬溶酶体Ag-Ab复合体被巨噬细胞摄入后在细胞内形成吞噬小体,后者与溶酶体融合,形成吞噬溶酶体。抗原可在吞噬溶酶体中被降解,形成具有免疫原性的肽段。,抗体、补体等调理素（opsonin）,促进吞噬细胞吞噬细菌等颗粒性抗原,IgG(IgG1和IgG3)：调理巨噬细胞吞噬IgE：促进嗜酸性粒细胞的吞噬。,63,（4）病理作用：介导I型超敏反应,IgE由于其Fc段的结构特点，可在游离情况下与有相应受体的细胞(如嗜碱性粒细胞,肥大细胞)表面的IgEFcR（FcR）结合,又称为亲细胞抗体。正常人血清中IgE其含量极低，超敏患者明显升高。IgE诱导的细胞脱颗粒，释放组胺，合成由细胞质来源的介质引起I型变态反应。,64,导致超敏反应的抗原变应原有：药物、异种动物血清、植物花粉、尘螨、真菌孢子、动物皮屑或羽毛、昆虫或其毒液以及鱼、虾、蛋、乳、蟹、贝等食物和某些酶类如枯草菌溶素。,65,花粉过敏的发生机制,66,67,过敏性休克呼吸道消化道皮肤,Ag与两个或两个以上IgE分子结合，使IgE受体发生交联,68,3.穿过胎盘和黏膜,灵长目动物、人类以及家兔的IgG是唯一可通过胎盘从母体转移给胎儿的抗体。与IgGFc片段结构有关，切除Fc段后所剩余的Fab并不能通过胎盘。IgG通过胎盘的作用是一种重要的天然被动免疫，对新生儿抗感染有重要作用。穿过粘膜细胞：分泌片与多聚Ig受体结合,介导IgA二聚体穿过黏膜，发挥局部抗感染作用,69,第四节各类免疫球蛋白的特性与功能,70,IgG,单体含量最高，机体抗感染的“主力军”唯一能通过胎盘的抗体，在新生儿抗感染免疫中起重要作用,71,IgM,膜型单体，B细胞表面，BCR分泌型5聚体；分子量最大最早出现，抗感染的“先头部队”如：血型抗体,72,IgA,血清型:单体分泌型IgA(SIgA)结构:功能:存在于粘膜表面及分泌液中（如乳汁）,参与局部的黏膜免疫。,73,IgE,单体血清中含量最少与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的FcR结合，参加I型过敏反应,74,IgD,血清型IgD，功能不清楚膜型IgD(mIgD)是B细胞分化成熟的标志。,mIgD,mIgM,未成熟B细胞,成熟B细胞,75,各类免疫球蛋白的主要区别,76,第五节膜型和分泌型Ig,由编码重链的RNA的交替剪切所致膜表面Ig（mIg）和分泌性抗体的H链结构相类似，不同的是mIgH的羧基端多含一段穿膜的疏水性氨基酸残基和胞浆区。因此mIgH链的转录本要比分泌性IgH链转录本多12个外显子。,77,第六节人工制备抗体,78,多克隆抗体：第一代抗体单克隆抗体：第二代抗体基因工程抗体：1.嵌合抗体2.改型抗体3.小分子抗体4.完全人源抗体5.双特异抗体重组多克隆抗体：第三代抗体,人工制备的抗体,根据制备的原理和方法可分为三类,79,一.多克隆抗体（polyclonalantibody）：大多数天然抗原物质(如细菌或其分泌的外毒素以及各种组织成分等)具有多种不同的抗原决定簇，而每一决定簇都可刺激机体产生一种特异性抗体。多克隆抗体是一种抗原多个抗原决定簇刺激机体后，由多个B细胞分泌的多种特异性抗体的混合物。由于抗体不均一，无论是对抗体分子结构与功能的研究或是临床应用都受到很大限制，因此称为第一代抗体。,80,二.单克隆抗体（monoclonalantibody,mAb）,由单一克隆的B细胞杂交瘤细胞合成和分泌的在理化性质、分子结构、遗传标记以及生物学特性等方面都是完全相同的均一性抗体，称之为单克隆抗体。mAb只针对某一特定的抗原决定簇，纯度高的抗体，因此称为第二代抗体。优点：高度特异性和均一性。纯度高、效价高、无交叉反应，易于大量制备，成本低。杂交瘤细胞：骨髓瘤细胞:无限增殖;免疫B细胞:合成和分泌Ab在医学中的应用：（1）诊断试剂：病原体以及肿瘤的诊断。（2）治疗试剂：兽医临床上传染病的治疗；医学临床上抑制器官移植排斥、治疗自身免疫疾病、制备生物导弹。（3）检测试剂：病原体毒力因子；免疫细胞及其它组织细胞表面分子。,81,每一种浆细胞克隆产生一种特异性抗体分子,mAb制备的基本原理,82,与抗体有关的诺贝尔奖获得者,83,单克隆和多克隆抗体的主要区别,pAbmAb产生细胞多种浆细胞克隆仅一种浆细胞克隆抗体非均一性均一性纯度不高高特异性不强强,84,三.基因工程抗体(geneticengineeringantibody),人-鼠嵌合抗体(chimericantibody)：鼠Fab-Fc改型抗体(reshapedhumanizedantibody)：鼠CDR小分子抗体：Fab片段Fc片段Fv片段完全人源抗体双特异性抗体：异源性H2/L2,在DNA水平对Ig基因进行切割、拼接或修饰，导入受体细胞表达的抗体。目的：鼠抗人源化，降低免疫源性；用于临床。,85,1.人-鼠嵌合抗体：在基因水平上将鼠源性单克隆抗体可变区和人抗体恒定区连接起来并在合适的宿主细胞表达2.改型抗体：将鼠单抗的CDR移植到人单抗的骨架区,单抗对复杂靶抗原的治疗效果相对逊色，特别是对病原体感染的疾病，至今只有一个抗RSV（呼吸道合胞体病毒）人源化抗体上市。,86,3.小分子抗体:Fab片段和Fv,优点：分子量小，容易穿透组织；Fab与具有杀伤功能的分子如毒素相连，形成生物导弹，Fab起导向作用，定向结合靶细胞，直接杀死肿瘤。,Fv与蛋白融合，改善药物动力学，增长半衰期,87,4.完全人源抗体噬菌体展示技术,88,5.双特异抗体(bispecificantibody),含有两种不同特异性抗原结合位点的抗体，一个抗原结合位点与靶细胞（如肿瘤细胞）结合，一个与药物（化疗药，细胞毒性细胞）结合，在靶细胞和药物之间架起桥梁，使药物直接高效地作用于靶细胞，提高疗效，减少副作用。,89,Theend,