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常规组织病理技术,1,常规石蜡切片制作程序 组织固定 取材 固定 脱水 透明 浸腊 包埋 切片 染色 封片 观察,2,一 固 定 1.组织固定的意义 防止组织细胞自溶和腐败 保持组织细胞正常生活时的形态结构 沉淀和凝固各种物质,硬化组织便于制片和染色后的观察,3,2.固定的注意事项 一般应在离体30分钟内固定,越及时越好,并将组织上的血液,分泌物冲洗干净 固定剂的量一般不少于组织块总体积的4倍以上 固定的时间应视组织的不同和大小决定,一般小组织4-6小时,大组织18-24小时或更长 有特殊要求的须用特殊的固定剂 不同组织在固定时应注意特殊的处理方法,4,3.常用的固定剂 甲醛(10%福尔马林) 甲醛 100ml 水 900ml 中性甲醛 甲醛 100 ml Na2HPO4 6.5g NaH2PO4 H2O 4g 蒸馏水至 900 ml 乙醇-甲醛(AF液) 甲醛 100 ml 95%乙醇 850 ml 冰醋酸 50 ml,5,其他 4%多聚甲醛 :多聚甲醛4g, 加蒸馏水50ml,加热至60度,搅拌加入1mol/L NaoH数滴,直至溶液变清,冷却后用0.1mol/L PBS( PH7.4 )加至100ml. Carnoy氏液(糖原,DNA,RNA,尼氏小体固定用,小组织20-40分钟,不超过3-4小时) 冰醋酸 10 ml 氯仿 30 ml 无水乙醇 60 ml,6,二 取 材 1.外科的活体组织取材 临床手术取材(大标本) 注意肿瘤的部位 形状 大小 颜色及周边组织的关系 ,有无完整包膜,测量体积,包括长度 宽度 高度.手术大标本必须进行预取材 预固定. 活体小组织(小标本) 组织标本体积小,在取材时应特别小心,用伊红让标本着色,并用插镜纸包裹,以防丢失,应标明粒数.多瓶组织应将附号标清楚.,7,2. 动物标本取材: 动物致死法 麻醉法,空气栓塞法,断头法,击头法,股动脉放血法等,要求动作迅速,及时解剖,取材与固定 动物取材注意事项:准备好锋利的刀剪,固定液,取材应新鲜,最好是心脏还在跳动时取材,并立即投入固定液.组织块厚度不超过3mm(应将组织上的血液,渗物,粘液粪便等用生理盐水冲洗干净,选好组织块的切面,切除不需要的部分,再固定),应尽可能维持组织原形,对神经肌肉皮肤组织,可将其两端固定在木板或硬纸板上,然后再固定.,8,三 脱 水 脱水的目的:组织最终将包埋在石蜡中,才能进行切片,为达到这一目的,首先须将组织内的水分置换出来,以利于透明剂渗入,这一过程为脱水.(一般情况下,应将大小标本分别脱水.标本脱水从低浓度开始,一般人标本从70%或75%乙醇,动物标本从50%乙醇开始) 脱水方法及注意事项: 常用试剂为乙醇,某些情况下用丙酮. 快速石蜡切片常用丙酮为脱水剂,尸体解剖标本一般在无水乙醇后加丙酮 因为脱水剂的新旧影响脱水时间,必须灵活掌握,根据本实验室情况,定时更换脱水剂.,9,四 透 明 透明的目的:因为大多数脱水剂不能和石蜡相混合,组织内的水份脱干净后,必须通过透明剂的作用,才能便于浸蜡包埋. 常用透明剂种类及注意事项: 二甲苯 甲苯 松节油 苯 透明要注意的关键是时间,透明时间不够,石蜡不能完全进入组织,影响到包埋 切片 .但是如果透明过度,组织发硬发脆影响切片质量.特别是肝脾等组织.,10,五 浸 蜡 目的和注意事项 组织经过透明后要浸入石蜡(火棉胶 碳蜡 明胶)内,目的是去除组织中的透明剂(二甲苯)而代之以石蜡,并渗入组织内部,把软组织变为有适当的硬度,以利切片. 一般浸蜡须经过2到3次,石蜡的溶点为56-58度左右,目前常用的脱水机上是两个蜡缸.浸蜡时要注意掌握好石蜡的温度和浸蜡的时间,11,六 包 埋 注意事项: 控制好包埋用石蜡的温度和组织块的温度,注意组织块包埋的方向,切面朝下,组织应尽量平整.蜡块冷却后将组织外围的石蜡进行修整,以便利于连续切片. 七 切 片 1.准备工作: 清洗干净的玻片 恒温烤片箱 毛笔 眼科弯镊 染片架 锋利的切片刀 制备好的蛋白甘油 石蜡块预先冷却,12,2.注意事项: 熟练掌握切片机的性能 展片箱的水温控制在45度左右 固定好蜡块和切片刀 切片附贴好后,放入65-70度烤箱中烤片 20-30分钟,13,八 染 色 目的:将组织切片浸入染色剂内,使组织或细胞等成分染上不同的颜色 产生不同的折射 ,以便在光学显微镜下观察. 方法:苏木素- 伊红染色称常规染色,又称HE染色. 其他染色方法称特殊染色(特染). 步骤: 1.将切好的组织切片经烤片后入二甲苯脱蜡各约5分钟左右,然后入无水乙醇洗去二甲苯,约1-2分钟,依次入95%乙醇,80%乙醇 70%乙醇至自来水,蒸馏水.,14,2. 将切片浸入配置好的苏木素液内5-10分钟左右,自来水洗1分钟,75%盐酸乙醇分化约30秒,返蓝1-2分钟 自来水洗5-10分钟 3.95%乙醇1分钟后入酸化的伊红10秒至1分钟,入95%乙醇各1分钟 无水乙醇各1分钟 ,电吹风吹干.,15,染色结果:胞核呈蓝色,胞浆淡红色,结缔组织鲜红色,红细胞橙红色. 染色液配置:苏木素是世界上唯一较好的常规细胞核染色剂,配置方法很多,各有特点,常用的有:Harris苏木素 Ehrlich苏木素 Mayer苏木素等. 在日常工作中,我教研室用Gill改良苏木素:苏木素2g溶于无水乙醇250 ml中,再将硫酸铝17.6g溶于蒸馏水750 ml中,两液溶解后将其混匀,加入碘酸钠0.2g,最后加入冰醋酸20 ml 特点:配置简单,色泽鲜艳,染液耐用. .,16,伊红Y染料是胞浆较理想的染色剂. 介绍一种沉淀酸化伊红Y乙醇液:伊红Y20g与蒸馏水500 ml充分溶解后加浓盐酸10 ml搅拌放置过夜析出沉淀,过滤后弃去滤液,蒸馏水洗涤沉淀,反复三次,将沉淀物连同滤纸一起放到恒温箱中干燥,用95%乙醇1000 ml配成饱和液备用. 用时取饱和液一份加95%乙醇1-2份即成工作液,17,染色注意事项: 1.切片脱蜡必须干净彻底 2.按操作步骤进行操作应严格掌握盐酸分化的时间 分化后的切片应立即入自来水洗 3.注意染色液的情况,掌握染色时间 4.按配方配置染色液.染色液配置的好坏是染色是否 成功的关键之一 九 封 片 国产中性树胶 封片,注意树胶量适中,掌握封片手法, 防止气泡.,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,
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