实验四 细菌、真菌、放线菌的分离与培养

.实验报告课程名称：环境微生物学实验 实验类型：综合实验实验项目名称：微生物的分离与培养与菌落观察学生姓名： 专业：环境工程学号： 同组学生姓名： 指导老师： 实验地点： 实验日期：2018年 10月16日一、实验目的和要求1. 掌握微生物接种培养技术2. 掌握微生物分离纯化技术3. 学习并掌握放菌落形态结构的观察方法，认识并理解它们的形态特征。二、实验内容和原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现具有重要价值微生物的主要菌源。在不同土壤中，各类微生物的数量千差万别。为了分离获得某种微生物,需要预先制备不同稀释度的菌悬液，并添加相应的抗生素抑制不需要的微生物，例如，添加链霉素2550U/mL抑制细菌;添加0.5%重铬酸钾液或制霉素50 U/mL抑制霉菌。通过10倍稀释以及平板分离、平板涂布和平板划线等操作，微生物可在平板上分散成单个的个体，经过适宜条件培养，单个个体可形成单个菌落。挑取单个菌落转接至新鲜平板上，即可使目的菌种纯化。1. 菌种的分离纯化：从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“单一性”，防止其他微生物的混入。2. 平板涂布法：因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。用途上，一般多用于从菌种的纯化;优点是可以观察菌落特征，对混合菌进行分离;但不能计数3. 平板划线法：最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。用途一般多用于筛选菌株。一般用于平板培养基的回收率计数。优点是可以计数，可以观察菌落特征。缺点是吸收量较少，较麻烦，平板不于燥效果不好，容易蔓延。如果菌液密度天的话，长不出单菌落。4. 稀释倒平板法：稀释倒平板法是将细菌与液态的培养基混合后倒入培养皿再冷却凝固，使样品中的微生物细胞充分分散开，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，单个细胞及聚在一起的细胞可以生长繁殖，形成一个肉眼可见的菌落，统计菌落数目，即可用以评价样品中的微生物的数量。所以细菌在培养基的内部和表面都有,适合厌氧型微生物。5. 菌种保藏：菌种保藏是将微生物的菌种经长时间的保存，不污染其它杂菌，及可保持其形态特征和生理性状，减少变异，防止衰老，以便于将来使用。保藏菌种一-般是选用它的休眠休，如孢子;芽孢等等，并且要创造一一个低温;干燥; 缺氧;避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体能长期地处于休眠状态。对于不产孢子的微生物，应使其新陈代谢处于最低状态，又不会死亡，从而达到长期保存的目的6. 菌落特征观察单细胞微生物丝状微生物细菌酵母菌放线菌霉菌菌落含水状态极湿/较湿较湿干燥或较干燥干燥菌落外观形态多样较大较厚、圆形，边缘整齐小而致密，粉末状大而疏松，或大而致密、呈绒毛状、棉絮状、粉末状等细胞相互关系单个分散，或有一定排列方式单个分散，或假丝状丝状交织丝状交织细胞形态特征小而均匀，个别有芽孢大而分化粗而分化粗而分化菌落透明度透明/稍透明稍透明不透明不透明菌落与培养基接和度不结合不结合牢固结合较牢固结合菌落颜色多样单调，一般呈乳白色或矿烛色。少数呈红色或黑色多样多样菌落正反面颜色差别相同相同一般不同一般不同细胞生长速度快较快慢较快气味一般有臭味酒香味泥腥味霉味7. 微生物分离培养结果观察：在环境样品的微生物分离过程中，虽然用了不同的培养基并添加了一定的选择性抑茵物，但并不能保证牛肉膏蛋白胨培养基上长的都是细苗，高氏号培养基上长的都是放线菌，马铃薯蔗糖培养基上长的都是真茵。因此，必须对微生物的的落形态进行识别。*菌落识别：菌落特征是细胞(首丝群体形态在宏观上的反映，是鉴定各类微生物的重要形态学指标。熟悉和掌握四大类敬生物细菌、放线菌、酵母药、需菌茵落形态的特征，对于菌种识别和筛选具有重要作用。*移植：从疏离孤独的单药落中挑取培养物接种至新鲜培养基。三、主要仪器试剂（必填）1. 菌源:选定采取土样的地点后，铲去表士层(23 cm)，取深层(310 cm)土壤109.装入无菌牛皮袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境特征和详细日期。取回土样后，及时分离菌种，若不能及时分离,将土样保存在低温、干燥的条件下，尽可能减少菌相变化。2. 培养基(10 mL装):牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，淀粉琼脂培养基，马铃薯蔗糖培养基。3. 无菌水:在250 mL锥形瓶中,灌装45 mL蒸馏水，放人10粒玻璃珠;在57支试管中灌装9mL蒸馏水，灭菌备用。4. 试剂:5000 U/mL链霉素液;0.5%重铬酸钾液或50 U/mL制霉素。5. 其他用品:无菌培养皿，无菌移液管，无菌三角玻棒接种环酒精灯，特种铅笔，标签纸，胶水，天平,恒温水浴锅，恒温培养箱。四、操作方法和实验步骤1. 土壤稀释液的制备：称取5克土至装有45ml无菌水的三角瓶(佛政璃珠)中，振荡10min (注意不要弄湿瓶塞)后，即成1O-1的土壤悬液，静置30秒后取样。取三支装有9ml无菌水的试管，分月编上10-2、10-3。10-4.用无菌吸管收取土壤悬液1ml，移入10-2管中反复吹吸三次，充分混匀后即得10-2稀释液，换一只无菌试管依次10-3、10-4稀释液。2. 划线法分离细菌：曲一瓶培养基先倒平板，带平板凝固后，用接种环从相应的土壤悬液取一环用分区划线法在平板上划线。在2830度下倒置培养，观察。3. 涂布法分离放线菌：倒平板前先加0.1ml0.5%重铬酸钾于灭菌培养皿中，并取配置好的培养基到平板。轻轻混匀培养皿上的重铬酸钾与培养基。待培养基干固后，用移液管移取土壤稀释液0.2ml于平板上，用三角波棒轻轻涂抹，在表面均匀抹开，在2830度下倒置培养67天，观察。4. 混菌法分离真菌：取5000U/ml链霉素0.2ml至于培养皿一边，再分别取10-4、10-3土壤稀释液各1ml，至于培养皿另一边，严防二者相混。向每皿倒入以融化并冷却至50度左右的真菌培养基，将培养基放在桌上进行运转，使菌液、链霉素、培养基混合均匀。待凝固后，在2830度下倒置培养56天，观察5. 细菌的分离纯化：(1)细茵:挑取单菌落，以分区划线法在平板培养基上进步分离纯化，后续进行生理生化鉴定。(2)放线菌:挑取单菌落，移植至斜面培养基(3)真菌:挑取单菌落，移植至斜面培养基五、实验结果与分析菌落照片菌落形态与描述细菌1*细菌菌落与培养基结合叫不紧密，容易被接种环挑起，有臭味，菌落分布不均菌落1：外形为不规则状，边缘为波形，表面稍稍隆起，表面湿润，淡黄色，稍透明，表面扁平，没有运动能力。菌落2：外形为丝状，边缘为丝状，表面湿润，呈乳黄色，表面扁平，遍布于大面积的平板，扩散至未划线区，为有鞭毛可以运动之细菌。菌落3：外形为圆形，边缘为光滑，表面湿润，乳白色，表面凸透镜状，没有运动能力。菌落4：外形为圆形，边缘为光滑，表面湿润，橙黄色，表面凸透镜状，没有运动能力。细菌2同细菌1，有菌落1、2、3、4。菌落5：外形为圆形，边缘为光滑，表面湿润，呈色，不透明，表面凸透镜状，没有运动能力。放线菌3*闻起来有土腥味，培养基变深色，菌落分布均匀菌落6：外形为不规则状，边缘为波浪形，表面湿润，乳白色，透明，表面突起，没有运动能力。菌落7：外形为圆形，边缘光滑，表面湿润，乳白色，稍透明，表面突起，没有运动能力。菌落8：外形为圆形，表面干燥呈细致粉末状，菌落呈非色，不透明，表面凸透镜状，菌落与培养基牢固结合。菌落9：外形为圆形，表面干燥呈细致粉末状，菌落呈白色，不透明，表面突起，菌落与培养基牢固结合。菌落10：外形为不规则状，表面较为湿润，边缘为不规则形，菌落浅黄色，稍透明，表面隆起。放线菌4*闻起来有土腥味，菌落分散不均菌落11：外形为圆形，表面干燥呈致密粉末状，菌落外围为白色考中心部位为灰色，不透明，表面隆起。有菌落6、10、9菌落12：外形为椭球形，表面较为湿润，边缘为光滑，菌落呈棕色，稍透明，表面隆起。真菌5*培养皿表面覆满白色绒毛状结构，从皿底一直延伸到顶部与皿盖接和，开盖时可以闻到一股霉味，从皿底看培养皿中的培养基呈黄色。菌落13：菌落表面覆盖有白色丝状的绒毛结构，其结构一被接种环碰到就会塌陷，菌落底部可以看见黑色的细小颗粒，有序的排列在菌落表面，从底部难菌落外围呈黑色，中心呈棕黄色。菌落14：菌落表面覆盖有白色丝状的绒毛结构，菌落底部可以看见呈黑色，为不规则状，边缘为波形。菌落15：菌落表面覆盖有白色丝状的绒毛结构，菌落底部可以看见呈棕色，外形呈椭圆形，边缘为光滑。真菌6*培养皿表面不像真菌5那般布满绒毛，但可见培养基上布满粉状的孢子菌落16：菌落表面覆盖有白色丝状的绒毛结构，外形呈圆形，边缘为光滑。菌落17：菌落表面覆盖有白色丝状的绒毛结构，外形呈不规则状，边缘崎岖。且菌落外边出现一无粉状孢子分布的小区。六、讨论、心得本次实验中初次的划线法分离细菌完成度较差，后续可做纯化单菌落较少，推测原因为在进行划线时线条过于密集，尤其是第四区的线，过于稠密，故难以得到独居疏离群体的纯菌落。而在放线菌的培养中出现了许多表面湿润的菌落，一其表面特征推测其非为放线菌，可能为细菌或酵母菌，且由于这些菌的污染使的许多放线菌的菌落无法使用，尤其在稀释倍数较低的涂布平板上此现象特别明显，因此可能下次可以提高加入的重铬酸钾的浓度。在真菌的培养中，由于霉菌的生长速度较快，其气生菌丝大多都已占领整个平板并开始散布孢子，应此几乎不可能得到纯种菌株，下次应可考虑将培养时间缩短，已做观察。七、思考题1. 什么叫做无菌操作?分离放线菌与真菌为何需要加入重铬酸钾和链霉素?无菌操作，是指在无菌室或超净台中进行以防止微生物进入人体或污染供试菌的操作技术。无菌操作是各种生物实验和生产实践中一项重要的基本操作。无菌操作的要求是：操作前将操作空间中的细菌和病毒等微生物杀灭；操作过程中保证操作空间与外界隔离，避免微生物的侵入。培养基中加入一些抑菌剂或者消毒剂等特殊成分，是为了抑制某些微生物生长，而目标微生物的生长不受干扰。链霉素对细菌有非常强的抑制作用，可以防止培养基上细菌生长过快而干扰霉菌的生长。重铬酸钾对土壤真菌、细菌有明显的抑制作用，而对放线菌无抑制作用，可作为选择性分离放线菌的一种高效、便宜的抑制剂。2. 平板培养时为什么要把培养皿倒置?皿盖向上培养时，培养基蒸发的水分会凝结在皿盖上，并可能掉落到培养基表面，影响培养结果。而培养皿倒置，水分蒸发会在培养基表面均匀凝结，并且蒸发与凝结会形成平衡，不会影响培养结果，同时水雾的形成也较不会干扰视线。这是主要原因。其次是倒置不会在拿起时只拿起皿盖。而正置时拿培养皿，可以只把皿盖拿起来，让培养基暴露在空气中。3. 好氧培养和厌氧培养的原理和方法有何不同?有氧培养：在有氧呼吸中，氧被用作最终电子受体。对于好氧微生物，培养中必须满足它们对氧的需要。实验室里常用的有氧培养方法有:平板培养、斜面培养、浅层液体培养、液体振荡培养和通气搅拌培养等。前三种培养方法借助空气自然扩散供氧;后二种培养方法依靠外力强制供氧。在工业生产(包括废水生物处理)上，多采用外力强制供氧，主要供氧方式有鼓风联气和机械曝气。无氧培养: 在无氧条件下，微生物能够以硝酸盐硫酸盐.高价供等作为电子受体进行厌氧呼吸;也能够以发酵中间产物作为电子受体进行发酵。无氧培养即为微生物创建一个无氧环境。常见的除险方法有物理法化学法和生物学法。4. 试述菌种斜面冰箱保藏、石蜡封藏、砂土管保藏、冷冻真空干燥保藏、液氮超低温保藏的原理及适用范围。l 斜面冰箱保藏法:将菌种接在新鲜斜面培养基上，定温培养长出丰满菌苔后，一般形成芽孢的细菌要形成芽孢，形成孢子的微生物要长出孢子，贴上标签，放在试管架上，在棉塞部位用尼龙紙或防水紙包好，放入4C冰箱中保藏。一般每隔3个月至半年用新鲜培养基移植1次。方法简便，实验室均采用。缺点:移接代数太多，易产生变异、退化。l 石蜡封藏法:在已长好的斜面菌种上加入无菌液体石蜡油，高出斜面1cm直立试管放入冰箱保藏，适用保存细菌和放线菌。石蜡的处理: 250mL三 角瓶装100mL液体石蜡，1.05kg/cm3高压灭菌30min,然后放在105C左右的烘箱中1h，使水分蒸发掉。l 砂管保藏法：把微生物附着在沙质载体上，置干燥处进行保藏，适合于保藏放线菌、芽孢细菌和某些真菌。保藏时间可达几年到几十年。l 冷冻真空干燥保藏：指将保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经预冻后在真空条件下使水分升华，再经真空封存后保存的一种长期菌种保存方法。其特点为保藏、运输方便、保藏时间长(5人 10年) ，但对设备要求高(真空冷冻干燥机、多歧管)，对人员操作水平要求高;冷冻干燥过程对菌体有损伤，需恢复培养。l 液氮超低温保藏：指悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移置于一196C的液氮或一150C左右的液氮气相中保存的一种长期菌种保藏方法。其特点为保藏时间长、保藏效果好，菌种不易退化;但对设备要求高(程控降温仪、对人员操作水平要求高;保藏成本高；液氮罐)。.