关于人-鼠嵌合抗体制备的可行性

.关于人-鼠嵌合抗体制备的可行性一、 概述人-鼠嵌合抗体，即抗体的可变区来自鼠单克隆抗体，而恒定区则来自人的抗体。它是通过从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞表达产生。嵌合抗体既保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力，又大大减少了鼠源性在人体内的免疫原性，其半衰期明显延长，且在介导CDC及ADCC方面亦明显增强。二、 市场分析附表是中国SFDA批准上市和进入临床的治疗型单抗药物抗体名称厂家靶抗原抗体类型适应症研发阶段Muromonab-CD3强生CD-3鼠源抗移植排斥批准上市Rituximab罗氏CD-20嵌合B 细胞非霍奇金淋巴瘤批准上市Trastuzumab罗氏HER-2人源化乳腺癌批准上市Basiliximab诺华CD-25嵌合抗移植排斥批准上市Trastuzumab基因泰克HER-2人源化乳腺癌批准上市OKT3武汉生物制品研究所CD-3鼠源抗移植排斥批准上市抗人IL-8单克隆抗体乳膏东莞宏远逸士生物公司IL-8鼠源银屑病批准上市重组人源化抗人表皮因子受体单克隆抗体注射液百泰生物药业公司人表皮因子受体人源化上皮源性肿瘤批准上市碘131I美妥昔单抗注射成都华神集团，第四军医大学鼠源肝癌批准上市碘131I人鼠嵌合型肿瘤细胞核单克隆抗体注射液上海美恩生物技术公司嵌合抗肿瘤批准上市重组人型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白上海中信国健药业公司肿瘤坏死因子人源化银屑病和强直性脊柱炎批准上市鼠抗人T淋巴细胞CD3表面抗原单克隆抗体济南天康生物制品公司CD-3鼠源抗移植排斥临床研究注射用抗肾病综合症出血热病毒单克隆抗体（I型）武汉生物制品所，第四军医大学鼠源出血热临床期抗人肝癌单抗Hepama1中科院细胞所鼠源肝癌临床研究抗乙型脑炎单抗北京生物制品所，第四军医大学鼠源乙型脑炎临床研究注射用重组人型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白上海美恩生物公司嵌合肿瘤临床研究目前国内上市的单抗药物有11个，其中5个是国外进口产品，我国上市的自行开发的治疗性单抗药物的有6个，处于临床研究阶段的有5个(表6)。其中，武汉生物制品研究所抗肾移植单抗OKT3（注射用鼠源性抗人T淋巴细胞CD3抗原单克隆抗体），也是最早批准上市的国内自行研制的抗体，具有免疫抑制作用，可逆转对移植器官的排斥反应；由北京百泰生物药业有限公司与古巴合作开发的I类癌症治疗新药“重组人源化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体”（商品名：泰欣生）于2005年4月11日获得国家I类新药证书。这是我国批准的第一个人源化单克隆抗体药物，它的问世标志着我国在癌症靶向治疗和人源化抗体药物领域取得重大突破，该药主要用于治疗头颈部、食管、肺部、乳腺、结直肠等部位的上皮源性肿瘤；由第四军医大学、成都华神集团股份有限公司联合研制的碘131美妥昔单抗注射液（商品名：利卡汀），于2005年4月20日获得国家I类新药证书。这是全球第一个用于治疗原发性肝癌的药物，也是我国第一个具有自主知识产权的抗体类药物。三、 应用嵌合抗体目前主要用于药物治疗方面，与鼠抗相比，嵌合抗体既保留了鼠源可变的高亲和性，又具有人Fc段的多种免疫杀伤功能，从而大大降低了人抗鼠抗体反应的发生几率，改善了临床治疗效果，与其它小分子基因工程抗体相比，嵌合抗体作为完成的抗体分子，在体内半寿期更长，并具有人Fc段的多种免疫杀伤功能。四、 技术路线从杂交瘤细胞中提取总RNA反转录合成cDNA扩增轻链、重链的V区基因插入含信号肽及人Ig重链、轻链C区基因的真核表达载体转染Sp2/0细胞克隆、测序分析制备腹水生产抗体检测抗体特异性与人源性酶切鉴定、测序分析五、 材料与仪器1 材料大肠杆菌DH5，大肠杆菌感受态细胞，T-A克隆载体T-Easy Vector，含信号肽及重链、轻链恒定区基因的质粒pAc-CH3，分泌单抗的杂交瘤细胞，真核表达载体pcDNA3.1，小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0。2 主要试剂氨苄西林钠，限制性内切酶，T4 DNA连接酶，Taq DNA酶，Trizol RNA提取试剂盒，反转录PCR试剂盒，琼脂糖，嗅化乙锭(EB)，dNTPs，DNA Marker，DNA凝胶回收试剂盒，质粒抽提试剂盒，胎牛血清，无血清培养液，二甲亚砜(DMSO)，转染试剂盒LipofectamineTM 2000，MTX，抗原，羊抗人IgG Fc片段-HRP酶标抗体。3 主要仪器低温高速台式离心机，恒温摇床，恒温水浴箱，水平式电泳仪，PCR扩增仪，紫外分光光度计，紫外透射仪，CO2培养箱，倒置显微镜，洁净工作台，酶标仪。六、 关键技术与方法1 可变区基因克隆1.1RNA提取及反转录取对数生长期的杂交瘤细胞株约107个细胞，按照Trizol RNA提取试剂盒的说明书抽提细胞的总RNA，再进行RT-PCR 扩增，回收纯化扩增产物备用。1.2扩增轻链、重链的V区基因根据Orlandi等（1989）设计的扩增小鼠可变区基因的引物，以上述扩增产物为模板扩增抗体基因的可变区。回收重链VH（约360 bp）、轻链VL（约330 bp）片段，插入T-easy载体，各送3份样品测序。测序所得序列在GeneBank 核酸数据库中进行分类及同源性分析。两端加入酶切位点根据上述PCR产物序列设计含酶切位点的引物，再次进行扩增，以使抗体可变区基因片段具有与载体相吻合的酶切位点，便于插入表达载体。回收纯化扩增产物备用。2 嵌合抗体表达载体构建改造含信号肽及人Ig重链和轻链C区基因片段的单克隆位点设计含重链信号肽起始位点序列及酶切位点Nhe 的上游引物HLF（KOZAK+4G，即GCCGCCATGG），和含Xho 位点的下游引物HLR，以质粒pAc-CH3为模板，扩增出重链信号肽基因片段；设计含Xho 和Kpn 位点上游引物HCF，和含Furin（RKRR）序列及酶切位点Xba 的下游引物HCR，以质粒pAc-CH3为模板，扩增出重链恒定区基因片段片段；用Xho 连接上述片段得到含重链信号肽、MCS及重链恒定区的基因片段。设计含酶切位点Apa 的上游引物LLF，和含EcoR 位点的下游引物LLR，以质粒pAc-CH3为模板，扩增出轻链信号肽基因片段；设计含EcoR 和Hind 位点上游引物LCF，和含Pme 的下游引物LCR，以质粒pAc-CH3为模板，扩增出轻链恒定区基因片段片段；用EcoR 连接上述片段得到含轻链信号肽、MCS及轻链恒定区的基因片段。构建含信号肽及人Ig重链和轻链C区基因片段表达空载体用合成的含酶切位点（Xba 和Apa ）的2A序列连接上述重、轻链，得到含信号肽及人Ig重链和轻链C区基因的基因片段LigC（Leader + Ig Constant）。然后与Nhe 和Pme 双酶切过的pcDNA3.1-CA大片段连接，即得到嵌合抗体真核双表达载体pcDNA3.1-CA（chimeric antibody, CA）。 pcDNA3.1图谱插入含鼠源Ig重链和轻链V区基因双酶切表达载体pcDNA3.1-CA和纯化的VL，经琼脂糖凝胶电泳分离纯化目的片段后,连接、转化大肠杆菌，筛选出pcDNA3.1-CA-VL 阳性克隆，富集培养后提取质粒进行酶切鉴定。然后，双酶切表达载体pcDNA3.1-CA-VL和纯化的VH，分离纯化相应的酶切片段，重复上述步骤，构建成重组表达载体pcDNA3.1-CA-XX（抗原单词的首字母）。3 转染Sp2/0细胞接种适量Sp2/0细胞于培养瓶中，培养12 h后用纯化的载体pcDNA3.1-CA-XX DNA,采用Lipofectamine 2000试剂转染，按试剂盒使用说明书进行。设置空载体和无载体的细胞为对照。转染72 h 后，加含MTX的选择性培养基进行筛选。2周后将生长出的阳性克隆利用有限稀释法单克隆化。4 阳性克隆鉴定与筛选以间接法用抗原和酶标羊抗人IgG Fc片段抗体检测嵌合抗体的特异性及重组性。以适量抗原包被酶标板，加细胞培养上清反应后，再加羊抗人IgG Fc片段-HRP酶标抗体（经鼠Ig吸附过）孵育，显色后测A490吸光值。5 抗体腹水生产腹腔种植转染瘤细胞，57 天后抽取腹水。一只种植杂交瘤细胞的小鼠有时可产生多达10ml的腹水。报道称从腹水中获得的嵌合抗体产量可达12 mg/ml。七、 时间及成本预算表1 时间预算项目时间（周）载体构建（外包，一次性）8杂交瘤细胞培养0.5RNA提取与反转录0.5引物合成1V区基因扩增与克隆2V区基因测序1插入表达载体及鉴定2表达载体扩增与抽提1转染Sp2/0细胞与筛选3嵌合抗体检测与筛选1总计（First Time）20表2 成本预算项目费用（元）感受态细胞T-Easy Vector载体构建（外包）T4 DNA连接酶Taq DNA酶限制酶Trizol RNA提取试剂盒反转录PCR试剂盒，琼脂糖，dNTPs，DNA MarkerDNA凝胶回收试剂盒质粒抽提试剂盒转染试剂盒LipofectamineTM 2000，筛选剂MTX羊抗人IgG Fc片段-HRP酶标抗体低温高速台式离心机水平式电泳仪PCR扩增仪紫外透射仪恒温摇床引物合成测序其它耗材总计（First Time）.