免疫荧光介绍

.免疫荧光介绍 免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位。一、基本原理及特点： 免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。 该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。 荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种。与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。国外生产的TDM用试剂盒，有相当一部分即属于此类，并且还有专供TDM荧光偏振免疫分析用的自动分析仪生产。由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。新发展了几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用。 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如 ELISA 或 Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在 4或-20避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像 WB 那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。二.荧光色素介绍： 许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有： （一）荧光色素 1 异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490495nm，最大发射光波长520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，结构式如下：有两种同分异结构，其中异构体型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是：人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。 2 四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。结构式如下：最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595600nm，呈橘红色荧光。 3四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）结构式如下：最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。 （二）其他荧光物质 1 酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-D半乳糖苷受-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光， 激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。 2镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3+）、铽（Tb3+）、铈（Ce3+）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3+应用最广。Eu3+螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。 所需要的仪器：荧光显微镜、显微荧光分光光度计、流式细胞仪和时间分辨荧光计等仪器 激光共聚焦显微镜 荧光偏振免疫分析用偏振光激发标记物，利用结合竞争免疫原理，可以快速检测激素种瘤标志物、维生素和多种治疗药物浓度。而且用于鉴定的材料也比较多样，可以是培养物、感染组织、分泌排泄物，也可以是土壤、水、杂物等。应用于生物酶含量及活性测定、临床医学检验、食品分析和环境监测、毒品检验。 选择荧光素主要考虑以下几点：高消光系数（extinction coefficient）和光子产量（Quantum yield），这意味着光捕获能力强和效率高；光稳定性较好；与常见光源和滤光器匹配性较好；不干扰抗体反映；水溶性以及 pH 稳定性。此外，还需要考虑到是否有毒性以及荧光素的颜色是否与背景颜色反差大对比鲜明等。三.荧光技术平台介绍:1.时间分辨荧光免疫测定 以常用荧光素作为标记物的荧光免疫测定往往受血清成分、试管、仪器组件等的本底荧光干扰，以及激发光源的杂射光的影响，使灵敏度受到很大限制。时间分辨荧光免疫测定（timeresolvedfluorescenceimmunoassay，TR-FIA）是针对这缺点加以改进的一种新型检测技术。其基本原理是以镧系元素铕（Eu）螯合物作荧光标记物，利用这类荧光物质有长荧光寿命的特点，延长荧光测量时间，待短寿命的自然本底荧光完全衰退后再行测定，所得信号完全为长寿命镧系螯合物的荧光，从而有效地消除非特异性本底荧光的干扰。TR-FIA的测定原理见图17-4。以双抗体夹心法为例的测定反应程序见图17-5。其中增强液的作用是使荧光信号增强。因为免疫反应完成后，生成的抗原抗体铕标记物复合物在弱碱性溶液中，经激发后所产生的荧光信号甚弱。在增强液中可至pH23，铕离子很容易解离出来，并与增强液中的-二酮体生成带有强烈荧光的新的铕螯合物，大大有利于荧光测量。所用检测仪器为时间分辨荧光计，与一般的荧光分光光度计不同，采用脉冲光源（每秒闪烁1000次的氙灯），照射样品后即短暂熄灭，以电子设备控制延缓时间，待非特异本底荧光衰退后，再测定样品发出的长镧系荧光。检测灵敏度可达0.21ng/ml。 2.解离增强镧系元素荧光免疫分析解离增强镧系元素荧光免疫分析（Dissociation Enhanced Lanthanide FluoroimmunoassayDELFIA）是时间分辨荧光免疫分析中的一种。它用具有双功能基团结构的螯合剂，使其一端与铕（Eu）连接，另一端与抗体/抗原分子上的自由氨基连接，形成EU标记的 经过免疫反应之后生成免疫复合物。由于这种复合物在水中的荧光强度非常弱，因此加入一种增强剂，使Eu3+从复合物上解离下来，自由Eu3+同增强剂中的另一种螯合剂螯合形成一种胶态分子团，这种分子团在紫外光的激发下能发出很强的荧光，信号增强了百万倍。因为这种分析方法使用了解离增强步骤，因此称为解离增强镧系元素荧光免疫分析。 两对半定量测定 乙肝病毒（HBV）标记物的检测方法常用测定乙肝病毒的抗原、抗体标记物，由60年代末70年代初的琼脂扩撒法，依次发展为血凝法酶联免疫吸附（ELISA）、同位素免疫标记（RIA）化学发光免疫分析、生物发光、电化学发光免疫标记和80年代中建立的稀土离子荧光标记（时间分辨荧光免疫分析 ）等不同的检测方法。随着科学的发展和检验技术的进步，其方法每发展一步，乙肝标记物检出的灵敏度和准确性都得到不同的提高(其中RIA为10-12mol/L、ELISA为10-9mol/L、CLIA为10-15mol/L、ECL10为-17/L、TRF为10-18mol/L)。其中时间分辨荧光免疫分析（TRF）为近年新研制成功的用三价稀土离子作为示踪物，以单克隆抗体包被支持物与样品中抗原反应，再加入用铕（EU）标记的抗体，进行反应检测，可大大降低一般同位素和荧光标记受环境干扰缺点，提高了检测的灵敏度和准性，该TRF法检测乙肝病毒标记物较其他方法灵敏度高、特异性好，因干扰因素少可大地优于以上各种方法， 可与HBV-DNA的检测相比(未经规范化要求开展的HBV-DNA检测，多年的临床实验证明，假阳性、假阴性率较高，重复性差，且不能定量。)，TRF为目前检测乙肝病毒标记物最理想的方法。TRF定量检测乙肝病毒“两对半”为临床诊断乙肝提供了新手段，有助于临床客观的分析HBV感染情况、疗效的观察和转归等情况的分析，至少可对下列情况更具有独特的诊断价值：1治疗前进行病毒定量检测，可以指导选择抗病毒药物，避免盲目用药。2治疗后定量间接判断体内病毒数量，有助于疗效的观察。3. 怀孕前进行定量测定，有助于选择有利的怀孕时机。乙肝孕妇进行定量检查，有助于使部分病人得到及时的正确的诊断 时间分辨荧光免疫定量测定乙肝两对半的临床意义 目前我科已正式开展了乙肝二对半的TRFIA定量分析，其每一项的正常值范围均是由我国卫生部根据美国雅培的标准而制定，其灵敏度，准确度，及精确度都有远远优于一般的ELISA法，乙肝两对半的定量制定将给临床提供一个关于乙肝诊断及疗效，预后判断的更可靠的实验结果。 1.极大地提高了检测的灵敏度 时间分辨荧光免疫定量技术（TRFIA）检测HbsAg灵敏度可达0.2ng/ml,而酶标（EIASA）检测的灵敏度是2ng/ml，极大地提高检测的灵敏度。因此，在急性乙肝早期能及早检出HbsAg，确证HBV感染，缩短窗口期；其次，可发现低浓度HbsAg携带者；在部分慢性乙肝患者中，由于机体缺乏对HBV包膜蛋白的免疫应答，HbsAg表达较低，酶标检测 可出现HbsAg和 HbsAb均阴性的情况，TRF技术则可避免这些情况的发生，为正确判断病情提供依据。 2.能动态观察疗效和监测病情 1） 定量分析HBsAg和 HBsAb的浓度变化，可预见急性乙肝是否处于恢复期。如HBsAg浓度降低，HBsAb浓度逐渐升高，可说明病情正往恢复期发展；反之，HBsAg浓度处于较高水平或上升趋势，而HBsAb一直处于较低水平，则易发展为慢性乙肝或病毒携带者。 2） 定量分析HBeAg和HBeAb的浓度变化，可反映病情变化和治疗效果。定量测定能明确检测HBeAg向HBeAb转换的时期，即表现为HBeAg浓度下降和HbeAb升高的过程。高浓度的HBeAg还可间接提示病毒处于高复制状态，具有较高的传染性。高浓度的HBeAb一方面提示病情好转，而在某些时候（如肝功能指标很差）则可能与肝坏死、肝硬化、肝癌有关。 3） HBcAb浓度的高低可反映病毒感染的状态。高浓度的抗-Hbc提示乙肝急性感染，恢复期浓度降低。慢性乙肝呈抗-Hbc持续高浓度。而低浓度的抗-Hbc一般为恢复期或既往感染。 4） 有利于对慢性肝炎活动性或非活动性的判断。非活动性慢性乙肝各项指标相对稳定，活动性往往呈现进行性变化。 3.TRFIA和定量PCR技术可互相补充 血清HBVDNA荧光定量PCR测定可以直接反映血液中病毒复制状态，具有很多临床应用价值，但不能完全反映病毒复制静息期肝细胞内HBV病毒状态。HBVDNA阴性并不完全代表体内HBV已被清除，结合“两对半”各项指标更能客观反映体内HBV病毒状态。 4.HbsAb的定量测定能够对乙肝的预防起到监督作用 HbsAb的定量测定能够对抗体是否真正具有“中和”HBV的免疫力作出正确评价，对乙肝的预防起到监督作用。HbsAb的含量在10mlU/ml以上病人ELISA检测即可呈阳性结果，但并不提示机体都一定具有免疫力，而HBsAb 的含量在10100mlU/ml之间的样本，定性虽为“阳性”，但此时机体对HBV的免疫力较弱，甚至不能预防HBV感染。只有HbsAb的含量达到100mlU/ml以上时才可确定具有抵抗HBV入侵的作用。作定量检测，可根据HBsAb 的含量判断机体对HBV的免疫状态及乙肝疫苗的免疫效果。因此定量测定对乙肝疫苗免疫力的评价和高危人群预防免疫具有重要意义，特别是在少年儿童预防乙肝方面。 3.荧光偏振免疫测定 荧光偏振免疫分析技术(FPIA),这是一种均相荧光免疫分析法,主要用于测定小分子量物质,如药物浓度测定。原理是:标记在小分子抗原上的荧光素经485m的激发偏振光照射后,吸收光能,越入激发状态,激发状态的荧光素不稳定,很快以发出光子的形式释放能量而还原。发射出的光子经过偏振仪形成525一550nm的偏振光,这一偏振光的强度与荧光素受激发时分子转动的速度呈反比,游离的荧光素标记抗原,分子小,转动速度快,激发后发射的光子散向四面八方,因此通向偏振仪的光信号很弱,而与抗体大分子结合的荧光素标记抗原,因分子大,分子的转动慢,激发后产生的荧光比较集中,因此偏振光信号比未结合时强得多。在测定过程中待测抗原小分子、荧光标记抗原小分子和特异性抗体大分子同时加入到一反应杯中,经过温育,待测抗原和荧光标记抗原竞争性地与抗体结合。待测抗原越少,与抗体竞争结合的量越少,而荧光标记抗原与抗体结合量就越多,当激发光照射时,荧光偏振的程度与荧光标记物分子转动的速度成反比,而荧光标记的小分子抗原与大分子抗体结合后,其分子的转动速度减慢,因此荧光偏振信号强。结果是待测抗原的浓度低,可以通过计算获得其含量。作为一种均相标记免疫分析技术，荧光偏振免疫方法与其它非均相标记免疫方法相比具有显著的优点：1）抗原抗体间的反应和样品分于的测定在溶液中进行进免了固相标记过程中反复多次的洗涤步骤届于实现自动化控制和提高分析方法的精度，FPIA方法的相对标准偏差（CV一般可控制在 35之间；2）检测过程仅需样品、示踪剂和抗体的加入和混匀数分钟甚至数秒钟孵育后即可测定荧光偏振光强度方法的测定速度快有利于大批量样品的分析测试；（3）因为荧光偏振不受内滤作用的影响，对于有颜色和浑浊的溶液仍能很好地完成检测任务：（4）不需要使用放射性问位素避免了污物不易处理的难题。4.荧光免疫法 原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min内得出结果。结果以Mb每小时释放的速率表示(Mb)表示。该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体抗原抗体复合物。最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。5.放射免疫法 放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原抗体复合物与无放射性的抗原抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。然后通过离心沉淀等方法，将抗原抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ngml水平。但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。 免疫荧光层析快速诊断试纸条主要是将特异性的抗原或抗体以条带状包被在NC膜的检测线T上，荧光标记的抗原或抗体吸附在结合垫上，当待测样品加到试纸条一端的加样垫孔上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的荧光标记的抗原或抗体，再移动至包被的抗原或抗体的检测线处，如果样品中含有相应的抗体或抗原，包被在检测线上的抗原或抗体和荧光标记物与样品中的相应抗体或抗原结合，形成免疫复合物，荧光标记物富集在检测线处形成一条通过激发产生荧光的检测线。如果待检血清中没有相应抗体，荧光标记物将不会与包被在检测线上的抗原或抗体结合，荧光标记物不会富集，检测线上不会出现能产生荧光的检测线。当样品与溶化了的荧光标记物继续往上移动至对照线时，就与包被在对照线处的特异性抗体或抗原结合，在对照线上形成免疫复合物，出现一条通过激发产生荧光的对照线。免疫荧光层析快速诊断技术，由于具有操作简单、速度快、稳定性好、灵敏度高、成本低等优点，已在医学、动植物检疫、食品安全监督各领域得到了日益广泛的应用。目前，医学检验中应用的免疫荧光层析快速检测技术主要有夹心法和竞争法两种方法。这两种方法都是以微孔滤膜为载体，包被已知抗原或抗体，加入待检标本后，经滤膜的毛细管作用或渗滤作用使标本中的抗原或抗体与膜上包被的抗体或抗原结合，再用荧光标记物与之反应形成可通过激发产生荧光的结果，从而达到检测目的。总之，免疫荧光层析快速检测技术开始逐渐得到广泛应用的免疫标记技术。作为一种检测技术与其他方法相比，如ELISA。RIA，金标记等，在许多方面具有无可比拟的优势，该技术操作简便、快速、特异，灵敏度高，全定量检测，特别适用急诊现场即时检测（POCT）和诊断。在今后的研究中，免疫荧光层析快速检测技术将更进一步显示其巨大的优越性，同时也将在更广阔的领域内发挥其作用。免疫荧光层析快速检测技术是以荧光物质作为示踪标志物，应用于抗原抗体反应的一种型免疫标记技术。近年来，该技术在医学、动植物检疫、食品安全监督等各领域得到了日益广泛的应用。免疫荧光层析快速检测技术的灵敏性与ELISA基本相近，许多试验的敏感度都可达到0.1 ngmL或更低水平，但是有些试验往往不能达到如此的敏感度，灵敏度的提高无疑会拓宽免疫荧光层析快速检测技术的检测范围。进一步寻找提高检测敏感性的荧光标记物，提高准确性及自动化程度，改进多元检测平台的方法学是未来免疫荧光层析快速检测技术的发展方向。6.偶联生物素亲和素系统的酶免法 利用了一个亲和素分子可以与4个生物素分子结合的特性，使传统的灵敏度较高的酶免法的灵敏度又有明显的放大作用。7.荧光定量 PCR 技术 常规 PCR 中，在扩增反应结束之后，我们一般通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，无法对 PCR 扩增反应进行实时检测，也无法对起始模板准确定量，而很多情况下，我们所感兴趣的是起始模板量， 如转基因动植物中插入某种外源基因的拷贝数或者病人中某种病毒 DNA/RNA 的精确 copy 数等，如此，荧 光定量 PCR 技术便应运而生。四.荧光技术平台具体介绍:1. 时间分辨荧光免疫分析法 时间分辨荧光免疫分析法(Time-resolved fluoroimmunoassay)是在荧光分析的基础上发展起来的一种特殊的荧光分析。它利用具有长效荧光的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）作标记物，充分利用激发光与发射光之间的降移与发射光较长的半寿期，在激发光后延时测量发射光的强度。从而所测的荧光不受激发光和被检物中的非特异荧光干扰，提高了检测的特异性与灵敏度。在激发光后延时400微秒，测量400微秒，间歇200微秒后进入下一个测量周期，每一个周期为1000微秒。对每一个样品实施1秒钟的测量，意味着完成了1000个周期的测量，测量精确度极高。（一）Auto DELFIA自动时间分辨荧光免疫分析仪 开/关程序1 开机1.1 依次打开样品处理器电源，微孔板处理器电源，打印机电源。1.2 打开计算机显示器。1.3 启动计算机。1.4 运行系统软件： Auto DELFIA与Multicalc系统软件在Windows启动后自动运行。Auto DELFIA workstation软件用于控制Auto DELFIA的运行，MultiCalc的主要功能是与主机通讯，对测试结果进行评估和对质控及其他数据处理（可通过双击屏幕上图标不运行）。在MultiCalc Auto DELFIA环境下，只有键盘有效，鼠标无效。2 开机后准备1.1 清洗液准备1.1.1 微孔板处理器洗液（250ml浓缩液600ml去离子水混合），每做一块板至少1升用量，洗液在密闭条件可保存2周时间。1.1.2 准备样品处理器洗液（50ml浓缩液5000ml去离子水混合），每做一块板至少需要800ml洗液，洗液在密闭条件下可保存1周时间。1.2 样品处理器准备1.2.1 在Wash bottle（清洗液瓶）、Rinse bottle (冲洗液瓶)分别注入足够用量的清洗液和去离子水，倒空废液瓶。拧紧各瓶盖，确保废液瓶管路向下。1.2.2 如样品需要稀释，放入稀释杯和稀释液。系统安装时已调好有71ml和190ml两种规格的稀释杯，若使用71ml的稀释杯，从最右端开始放置，如有预处理样品，则不能使用190ml的稀释杯。不能使用多个稀释杯。1.3 微孔板处理器准备。 1.4 点击Load菜单下的Load System Liquids选项Option-Show Tempareture显示温度和压力。当管路内有压力时，不要打开瓶盖。1.5 点击Maintenance Plate Processor Washer test，检查洗板机功能，系统自动提示检查步骤。1.6 在试剂舱内插入足量干净、不弯曲的吸嘴。1.7 装载足量干净的稀释杯，每一稀释杯分为两半，可做两次稀释，总共有24个稀释位。1.8 检查检测帽（白色）是否放入试剂舱最左边第一个帽架位置，并且其他位置没有黑色防蒸发帽。1.9 确认传送器下方的废物盘已倒空。1.10 检查两瓶增强液是否足够（一瓶可做8块板），通常先换右边的瓶子，但如左边瓶内溶液少于1/3，则两瓶均须更换。增强液瓶内有压力，必须拧紧盖子。必要时使用Maintenance菜单下的 Enhancement solution flush 命令灌注管路。1.11 校准品：每瓶hAFP和hCG校准品瓶中精确加1.1ml去离子水，轻轻混匀，30min后去除泡沫使用。需再次使用的校准品保存于-20。1.12 Eu/Sm标记物溶液：在使用前1h，根据每条板条（12孔）需30l标记物和30ml缓液配制标记物溶液。 3 关机3.1 关闭微孔板处理器电源。3.2 用探针支架支撑探针架防止损坏，关闭样品处理器电源。3.3 退出Auto DELFIA系统软件，退出MultiCalc软件。退出Windows。3.4 关闭电脑电源。（二）Auto DELFIA自动时间分辨荧光免疫分析仪 分析参数设置程序1 检验项目设置1.1 在操作主界面点击Settings菜单 选择Assay Protocols（检验项目）。1.2根据需要选择校准曲线、样品复管数、批号和质控。使用新批号试剂时，则更新批号。如果选择了参考曲线，批号改变后系统自动提示需做一条新的曲线。1.3 若欲将结果存到LIS系统中，确认在MultiCalc中Protocol的 Stored Files里选择Results，并选择Resulte格式。1.4 如果要做双标，须先做溢出纠正因子校正（详见维护保养部分）。1.5 如果做新生儿筛查，在Settings菜单系统子菜单下选择新生儿筛查。编辑检验项目、校准和质控。1在主界面鼠标点击Settings菜单，选择Assay protocols 如 Screening AFP-BHCG Edit 。2进入Assay protocol editor 对话框。输入相应的批号，根据试剂说明书上标注输入正确的校准品浓度值。（三）Auto DELFIA自动时间分辨荧光免疫分析仪 校准程序。1.1选择校准模式：有7种不同的选择，在屏幕左边从上到下依次是每一测试块均做标准曲线；第一块测试板做标准曲线，其余的做两点校正；第一块测试板做标准曲线，其余不做校正和校准；每一测试板均做两点校正；第一块测试板做两点校正，其余不做校正和校准；不做校正和校准，使用上一次标准曲线；不做校正和校准，使用MultiCalc中设定的参考曲线。1.2 如果还有其他需要，可更改校准品数目。例如要求第一块板做标准曲线，其余的做3点校正，则选择第二项，然后在“Next Plates”下选择相应的3个标准即可。1.3 如果做双标（Dual Label Assay ），例如AFPhcg，则无法更改校准品的数目，只能修改浓度值。双标有A-Protocol和B-Protocol两种协议，要更改B-protocol的浓度值，点击屏幕右下角的 B-protocol 键。弹出新对话框，可修改校准品和质控浓度值，然后按 OK 保存退出。返回到Assay Protocol Editor对话框。1.4 复管数：在屏幕右下方点击 Replicates ,输入校准品、质控品及待检标本的复管数，按 OK保存，返回Assay Protocol Editor对话框。 1.5 在Assay Protocol Editor对话框输入校准品批号，输入正确的校准品浓度值。1.6 进入Map Of Standards 对话框，拉出校准品抽屉，按屏幕提示顺序依次放入校准品，放好后合上校准品抽屉，按OK 。使用后，校准品立即放置于4冰箱内保存。校准品打开后最多使用二次。在标准抽屉内一次最多可放8个项目的校准品。1.6 运行（四）Auto DELFIA自动时间分辨荧光免疫分析仪 室内质控程序1.1 点击屏幕右边 Controls进入Controls 界面，输入质控的允许范围（目标值2S）、质控代码、质控批号，必要时在Dil中输入质控稀释倍数。1.2 在屏幕左边Controls栏选择质控做在第一块板或下一块板或最后一块板。在屏幕下部的测试板图上已显示有校准品。在屏幕右边Control Operation 栏中选择所用的质控水平（Low、 Medium、High、Control 45），然后移动光标到板上所要放置的位置。1.3 必要时选中Move Control、Delete control对质控进行移动和删除操作。1.4 然后按 OK键完成编辑,按 Close键保存。1.5 运行三、运行1 工作前准备（二）创建工作表在以上准备工作完成后，有两种方法检测。即点击AutoMate（自动操作）键，系统会按预定的程序执行。或选择Load Worklist 或Create list一步一步运行。在Auto DELFIA软件中创建工作表，还可在已存在的工作表中添加样品：用鼠标点击空位置，然后输入所须的项目即可。（如果试管已经放入样品处理器中，则不能添加项目）。321编辑试管架图1 在主屏点击Create list图出现Analytes & samples 和Sample Racks 两个对话框。2 进入Sample Racks（样品架图），点击想添加样品的位置，会出现一红方框。注意要确保选择的位置与试管架上样品的实际位置对应。通过对话框下方的按键可实现以下功能： 点击 Plate Map 看微孔板图。 选择一试管，然后点击 Del Tube删除该管检测。 Print打印样品信息。3在屏幕试管架图最后一排编号为73的单独试管架，是质控架，如已在检验项目中设置了质控品，则自动显示在质控架上。322 移动试管架1在想插入试管架的编号区输入希望的试管架编号，则该位置上插入了你输入编号的试管架，其余试管架相应后移。2如不使用1号试管架，则必须移动试管架或将试管直接编制到适当的试管架上。323 移动质控架如要把质控放到其他试管架，在当前质控架73编号区输入想放质控的编号。如把73号改成40号，则40架号成为质控架而原质控架73号变成普通的样品架73。324 移动试管用鼠标点住想移动的试管，将其拖到需要放的位置，然后释放鼠标。在试管架图左下角显示出鼠标位置、试管数和稀释液位置（从右到左排列）。完成试管架安排后，点击Close，关闭Sample Racks 对话框。325 项目和样品1 在Analytes & samples对话框中，在Analytes栏中选择检验目的2 在屏幕右边的下拉菜单中选择测试项目。Screening的下拉菜单中只显示已校准的测试项目。3 选择合适的试剂盒（1板或4板）及程序（不同温育时间）。4 选择合适的运行序号，按OK 。进入Sample 对话框。注意： l 在设置菜单中选择了新生儿筛查后，才能按需要间歇振荡筛查项目。l 如果在系统设定中选择了下一管，则需要预处理的实验将不显示。5在Sample 对话框的Code区输入相应的样本ID号，连续样本以2个点（.）连接起始ID号与未尾ID号，即xx.xxx 。点击 Accept 或按ENTER键。6在样本类型栏中选择合适的试管，否则吸样探针会吸错位。7确认前可在项目列表中双击项目名称以删除测试；如果已按Accept键，可在微孔板图中删除管。8已经确认后也能增加测试样本。包括使用微管稀释样品添加测试项目，但系统设定中选择下一管或下一架，则不能添加。注意不能更改已确认样品的稀释状态。9确认后，样品架图上选中的试管位颜色发生改变，绿色为样品、浅兰色为用来稀释样本的空管或经稀释的质控或经预处理的标准、红色为质控。10必要时，在Sample 对话框的Factor栏中输入稀释倍数（5-100），按Accept键。在试管架上会显示出稀释管的位置。所有稀释管标本设定好后，按Accept键。注：定义稀释管时试管类型仍然为样品管，按确定键后，会自动变为稀释管。如果样品处理器类型为1297-014，必须在稀释管槽内从右到左依次放入稀释微管。在稀释杯内加入适当稀释液。11预稀释倍数：在此Pre-dilution中输入样品加样前的预稀释倍数，以便MultiCalc能计算出正确的结果。12原始标本：选择Use primary，则系统会吸取等量的稀释样品和原样品。否则只吸取稀释样品。该功能只是对选中的项目有效。13复管数：如希望样品复管数不同与检验项目中设定的复管数，在 # Repl栏中输入需要的复管数。该功能只是对选中的项目有效。14增加管：Add tubes显示除样品外的其他和该待测样品有关的试管数，如稀释管、微管等。15.条形码：选中Barcode ，则以条形码来识别试管。326 微孔板图：1点击样品架图下方Plate Map按键，显示测试项目的微孔板图。图中黄色为校准品，红色为质控，绿色为样品，浅兰色为稀释液，紫色为稀释质控，深兰色为手动样品，灰色为空管。2在微孔板图左下方显示实验板总数、当前第几块板和在浮育器中的位置、试剂盒的总数及位置。3按 Prev 和 Next ，显示前一板和下一块板状态。4按 Delete test 、 Delete Plate 和 Delete Well 分别可删除当前测试项目、删除当前测试中的最后一块微孔板、删除选定的微孔，同时与之相应的试管也被删除5按 Pack Plates ，整理删除后的微孔板。6按 Rack map 键，系统提示装载微孔板，然后直接进行测量。327 结束创建工作表工作表创建完成后，按仪器上的Load按扭装载样品，然后鼠标点击屏幕上的 Close ， 结束创建工作表，此时系统会显示出校准品图，装载校准品。（五）Auto DELFIA自动时间分辨荧光免疫分析仪 试剂/材料装载程序1 样品管/架装载1.1 锁定加样臂：在装载试管架之前，按Lock键锁定加样臂，装载完毕后按Lock释放加样臂。1.2 将有红色数字标记的质控试管架和样品架依次放到装载位置，质控架在最前面，从样本运送器最右边的起始端开始装载试管架，将试管架有条形码端向外。关上进样仓盖子，按Load键。1.3 待质控架检测完成后自动退出，放于样本处理器中央的特定位置，关上盖后按Load键，仪器自动装载样品架。1.4 如在系统设置中选择了稀释微管，根据系统提示所需的稀释微管量，从右向左装载稀释微管。1.5 装载完毕，按Close 键如果样品量非常少，可以手动加样（在Analytes & samples的Tube type列表中Man. Pipetted 或在Worklist 的 comment区域中输入M 。待仪器对其他孔完成吸样后，系统提示手工加样到呈深兰色的空孔，操作者拿出板加样，要求每孔加样时间不超过2分10秒，在屏幕上显示倒计时，完成手工加样后，按IN/OUT按钮，或按OK 以确认已手工吸样。否则，到时间后板被自动运送到下一步操作区，并报警为未手工加样）。9点击主屏上的Schedule 按钮，在屏幕上显示检测项目的最佳顺序和时间进程。不同的颜色代表不同的功能。黄色表示测试板的加样时间、深兰色表示孵育时间、浅兰色表示稀释时间或预处理时间、红色表示清洗、加液等时间。在Priority 栏下，对不同的项目设置不同的优先级，从而再制时间表。2 微孔板装载1 鼠标点击Load plate 图标，样品处理器加样臂自动移到左边以方便操作。这时屏幕出现装板信息。在每行前面的红箭头表示正在装载的微孔板。2 由于系统的洗板机每次清洗两条板孔，如测试板条为奇数，则用清洁的空板补足成偶数板条。3 检查每个板孔是否潮湿，可用干净软纸擦干。否则会造成板条感应出错，和测量荧光时计数错误。4 待微孔板支架到位后，依列表顺序将第一块微孔板放到支架内，微孔板的条形码向右（A板条在右边），然后按IN/OUT键，系统自动将微孔板送进温育器内。如有第二块板，系统读取完板的批号后，微孔板支架返回装载位置继续装载，直到所有微孔板装载完毕。5 如板上条码读不出，则显示错误信号。如板放错位，点击Retry 后取出板，以正确方法重新放入支架中，如果是条码的问题，则点击Ignore 并输入板的批号，不必输板的系列号。6 在装载板时，系统检查每一次板的支架在孵育器中的位置，如有问题，则该板就不能被装入，并需要重新运行系统，启动程序会把支架重新带入孵育器中。3 试剂装载1 点击Load reagents 图标，显示需要装载的试剂及相应的信息，每行前面的红箭头表示正在被条码机读取的试剂盒。根据提示检查相应的信息。2在试剂杯(cassettes)右边帖上条形码，条形码上的批号要与试剂盒上的一致。在条形码上还标有微孔板的编号，用来定义相应的微孔板。3根据屏幕列表所示，在试剂架上从左到右依次放置已开盖的所需试剂 ，在示踪剂和抗体瓶上放黑色的防挥发帽。示踪剂的位置标记在试剂杯的底部。试剂杯有四种类型，适用于不同的试剂。4放好所有试剂后，按 OK 键，条形码开始读取试剂条码，完成后提示装载微孔板。（二）Auto DELFIA自动时间分辨荧光免疫分析仪 开始运行1点击Start run 图标，开始自动运行，显示试剂架各试剂和消耗品的情况。 2 按照图中的位置检查试剂位置、吸嘴、稀释杯及板条量是否正确，点击 OK 。3 屏幕上显示微孔板处理器和样品处理器的液体量。检查是否达到屏幕所示的最低限度液体量。注：残留量 ：样品处理器： 清洗瓶为 -2.5L ；去离子水瓶为 -1.5L 稀释液瓶为 -6mL。微孔板处理器：清洗液瓶和去离子水瓶均为 -1.5L；左边增强液瓶不少于1/3瓶。4 检查完毕后按 OK ，系统开始自检准备运行。确认吸嘴、稀释杯、防蒸发帽是否已经放好，各瓶液量足够、废液瓶有足够的空间等。自检无误后，屏幕显示出测量时间表并开始运行。5 运行进程屏幕出现测量进程图，实时显示当前运行的状态及时间。如果运行过程中由于某种原因进程被终止，会在进程图上显示一红叉，可在历史记录中查阅有关信息。注意：出现问题后，下次运行之前请重新启动系统。（七）运行结束运行结束后，测出的计数值被保存在计数文件中，计数值由MultiCalc计算后打印出。确保MultiCalc处在计数状态以保证结果会自动输出。（八）卸载运行结束后鼠标点击Unload 图标，选择卸载样品/卸载微孔板，点击 OK 键，按提示卸载完成后鼠标点击取消键。（九）查看加样图加样图是一812的矩阵图，对应微孔板的每一孔。在每一孔内有如下信息：序列号、探针号、试管或校准品、计数值和错误信息。其中：探针号：第几根探针进行加样。试管或校准品：所加样品为血清或校准品。其中R代表试管，S代表校准品，D代表稀释微管，P代表位置。例如：R2P3代表试管架2的第3个试管。计数值：实际测量出的计数值。错误信息：L-液体量过少（兰色代表稀释液过少，绿色代表预处理故障）；E-空试管或校准品瓶；C-加样探针堵塞；F-液体表面有气泡；W-交叉污染警告。鼠标左键点击每一孔，可看每一孔的详细信息。四、结果测试结果保存到C:wiacalcoauxAfp-bhcg.a文件中，将该文件拷贝到f:中。（二）Auto DELFIA自动时间分辨荧光免疫分析仪 维护保养程序（一）该软件提供了维护计划表。每次维护都会被记入数据库存档。1在主屏点击 Maintenance 图标的History ，输入用户名 OK 2进入 Maintenance History 窗口，显示当前仪器保养情况和下次保养时间。3在Maintenance History 窗口，点击Settings键 出现Maintenance Settings窗口，激活需做保养检查盒，在Reporting框中可选择off 或overdues或 All OK 2 在Maintenance History 窗口点击 Register 键，选择所需的保养方式 OK 接受。（二）每日保养52.1 Washer test洗板机功能测试 1 点击Maintenance /Plate processor ,进入Plate washer 界面 OK 2 把一块96孔空的微孔板平稳地放于微孔板的支架上，按IN/POUT按钮。3 板被送入仪器内，系统检查板条数并灌满洗液后返回到载板位。4 用仔细检查每个孔是否均注满，再放入载板位，按IN/OUT按钮。5 板进入仪器后孔内液体被吸干，然后板被送出。6 检查各孔是否完全被吸干。可重复操作，检测完成后按 Close 键。7 如有孔没有被加满或吸干液体，可使用洗板机清洗保养程序。 522 Waste tray 清理废物盘倒空废物盘内的吸头，用自来水冲洗，晾干。523 Sampl e processor tubing 样本处理器管道1 检查样本处理器管路系统在灌水过程中是否有气泡。如仅有小气泡则没问题；如果是大气泡，可用Maintenance /Sample processor /Rinse 命令冲洗系统将气泡排出；如有大量气泡不能被排除，先检查蠕动泵内管路连接和四个阀门是否有故障。2 在注射器中偶有小气泡不成问题，但如存在大的气泡，而且经轻轻拍打注射器或拧紧接口、拉直管路也不能排除的，则要考虑更换注射器。524 Rinse冲洗（Rinse）进入Maintenance /Sample processor/Rinse OK 。用去离子水冲洗样本探针并浸泡针管。通常在运行样本测定后仪器会自动冲洗。525 Temperature温度点击Options /Show temperature ,以检查温度调节功能。通常在下列条件下，温度在252范围内：室温15-30；板处理器合上盖子；在启动后至少二h保持温度稳定，如果不在这一范围联系工程师。（三）每周保养531 Instrument cleaning仪器清洗进入Maintenance/instrument cleaning，显示消毒或清洗项目及所需的时间，根据需要可选择进行。1 选择对样本或板处理器清洗、消毒后，拿掉其他样本支架，按Yes 。接着对话框要求倒空废液瓶，把装有50ml 0.2 % 的次氯酸钠溶液（2000PPM Cl ）或70%-80%乙醇溶液的瓶子放入试剂盒子最左边位置，并在试剂架的起始位置放两个吸头，放一空的微孔板，按OK 键或IN/OUT按钮，板进入仪器内开始消毒。完成后板回到装载位，取出。 2 如用于新生儿疾病筛查中FT3或FT4的检测，则必须对移动盘进行消毒，这只能与洗板机消毒同时进行。3 使用高效含氯溶液对板处理器消毒前先倒空废液内液体再消毒，因为增强液会降低废液的 PH值而释放氯气。 装载板，点击OK或按板边上的IN/OUT按钮， 4 当清洗探针时，把盛有1：20倍稀释的DELFIA Wash液的8支试管放于试管架上，用内径9-14mm的圆底试管，按OK，输入试管架号（系统提供），按OK。5 当消毒探针时，系统提示放置一个含70%-80%乙醇消毒液的8管洗液和4管水的架子，每管液体量至少35ml 。高氯溶液、丙酮、变质酒精会毁坏探针。如果选择了探针清洗和消毒两项，系统会完成清洗后进行消毒，最后会用水清洗。6 倒空废液瓶并移去微孔板后按Yes键，把工作记录入档。最后用“Unload sample racks”命令取出支架。 532 Enhancement Solution outlet 增强液出口检查增强液出口处是否曾有液体溅出，如有用棉签拭干净。533 Sample processor bottles 样本处理器瓶启用“Load menu”菜单下”Load system liqids”命令，要求倒空废液瓶内液体，对洗液瓶和清洗瓶做排空和再灌满，然后按OK 。（四）每二周保养541 Sample processor样本处理器1、关闭样品处理器电源同时用手托住探针固定器，然后轻轻放低探针，搁置于放有干净纸的水平台上，以防探针突然掉下而损坏。 2、用蘸有7080%乙醇的软质布擦洗样品处理器上的齿轮。 3、probe Wash wells 探针清洗池：用移液管排空液体后，用小刷子清除异物，同时灌入7080%乙醇约10min后，用清洗程序用水冲干净。542 Plate processor 板处理器关闭所有应用程序、板处理器电源和计算机电源。然后打开系统电源，先打开样品处理器，再板处理器，最后启动计算机。54.3 Bottles 瓶子选择“Loading”菜单下“ Load system liquids Bottles”命令，按提示倒空洗液瓶和清洗瓶内剩余液体后，各自加满液体；倒空废液瓶内液体后按OK。（五）每月保养551 Bottles 瓶子1、倒空样品处理器和板处理器的洗液瓶并冲洗干净。2、倒空废液瓶，必要时可用大约1升的0.1-0.5%的高氯溶液消毒,盖上盖子,摇晃后放置30min,然后用水冲洗。3、必要时用湿布清除传感器或盖子上的污垢。552 Sample processor tubing 样品处理管路1、 用DELFIA洗液（1：20）冲洗样品处理管路系统后用去离子水冲洗。2、 将管路取出后放入盛有7080%乙醇（不带丙酮）消毒液的瓶子，并使用“Rinse”命令再冲洗。3、 将管路放回各自加满液体的洗液瓶和清洗瓶，用“Rinse”命令冲洗五遍使去离子水充满管路。553 Cleaning the covers, racks, and mirrors 擦洗盖子、支架和镜子1、用7080%乙醇擦洗板处理器上的塑料盖和样品处理器上的盖子。先用自来水再用去离子水冲洗水平托盘的盖子；2、同法冲洗试剂架（冲洗后立即擦干，不能浸泡）、样品架；3、如试剂分配器上套吸头的部分有红色沉淀物，则用湿的纸擦掉；4、蘸有7080%乙醇的湿软布擦洗试剂架传动杆；5、用“Unload plates”命令将板固定器取出，清洗板固定器上的镜子。554 Washer cleaning 洗板机清洗1、启动“Maintenance”菜单下“Plate processor”栏中的“Washer cleaning”命令，可拆下洗板机多头吸嘴进行清洗。（建议由经过培训或公司专业人员操作）2、待多头吸嘴移动到方便操作的位置，关闭板处理器电源以确保安全，如果操作不方便可移去增强液，但注意一定不要碰到增强液管路，以免污染。3、将多头吸嘴往上抬高后往左移动，小心地卸下多头吸嘴，避免分配针和吸液针损坏。注意不要在托架上太使劲。4、先在传送带上铺上纸巾以免水滴进仪器，然后小心地将管路从吸嘴上取下来，不要不正当地拉伸小直径管子。5、移去吸嘴上方的橡皮盖子，清洗整个腔室，使用维护盒内提供的相应直径的通针清洁吸液针和分配针。6、分配腔室上的四个硅胶塞子按以下方法拆下，注意不要损坏四个孔，以免破坏密封性。（1）用小别针移去一边的两个帽子。（2）在台上铺一块布，用维护盒内提供的清洁刷将腔室里剩余的帽子推出，直到刷子的头能看见。（3）用布拭净刷子上的异物后抽回刷子。同法清洁其他腔室。（4）用合适的通针再次清洗分配针，用清洁刷再次清洗腔室。清洁刷不能它用，以免污染。（5）分配腔室与吸液腔室均应用去离子水灌满后摇动清洗。在装回前先晾干或用干净纸擦干，小心别将纸片留在针上。（6）将橡皮封塞装回原来合适的位置。（7）在装新硅胶塞子时必须确保腔内通道干燥及所有内置帽子都在合适位置。最上面的帽子位置稍低于腔室外壁。（8）检查所有的针是直的，而且定位正确。（9）重新连接管路，将多头吸嘴放回支架上，检查是否能自由上下移动。（10）安装完成后，按OK 键，确认多头吸嘴已装好，管路已连接后按OK 。（11）系统提示打开板处理器电源，并重新启动工作站，运行洗板机测试以保证安装到位。（六） 每季保养 561 Pipetting precision check 移液管准确性检查 1、将400-600l（依测试的体积而定）1nmol/L铕溶液分别移入48支9 mm试管中。2、从“Create List”菜单下“analytes selection” 中选“Use made” 项。3、选sample