代谢组学在医药领域的应用与进展

.代谢组学在医药领域的应用与进展一、学习指导1.学习代谢组学的概念及内涵，掌握代谢组学的研究对象与分析方法。2.熟悉代谢组学数据分析技术手段3.了解代谢组学优势特点4.了解代谢组学在医药领域的应用5.了解代谢组学发展趋势二、正文基因组功能解析是后基因组时代生命科学研究的热点之一，由于基因功能的复杂性和生物系统的完整性，必然要从“整体”层面上来理解构成生物体系的各个模块功能。随着新的测量技术、高通量的分析方法、先进的信息科学和系统科学新理论的发展，加上生物学研究的深入和生物信息的大量积累，使得在系统水平上研究由分子生物学发现的组件所构成的生命体系成为可能1。系统生物学家们认为，将生命科学上升为“综合”科学的时机已经成熟，生命科学再次回到整合性研究的新高度，逐步由分子生物学时代进入到系统生物学时代2。系统生物学不同以往的实验生物学仅关注个别基因和蛋白质，它要研究所有基因、蛋白质，代谢物等组分间的所有相互关系，通过整合各组成成分的信息，以数学方法建立模型描述系统结构3,4。（一）代谢组学的概念及内涵代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后，系统生物学的重要组成部分，也是目前组学领域研究的热点之一。代谢组学术语在国际上有两个英文名，即metabolomics和metabonomics。Metabolomics是由德国的植物学家Fiehn等通过对植物代谢物研究提出来的，认为代谢组学（metabolomics）是定性和定量分析单个细胞或单一类型细胞的代谢调控和代谢流中所有低分子量代谢产物，从而监测机体或活细胞中化学变化的一门科学5。英国Nicholson研究小组从毒理学角度分析大鼠尿液成份时提出了代谢组学（Metabonomics）的概念，认为代谢组学是通过考察生物体系受扰动或刺激后（如某个特定基因变异或环境变化后）， 其代谢产物的变化或代谢产物随时间的变化来研究生物体系的代谢途径的一种技术6。国内的代谢组学研究小组基本用metabonomics一词来表示“代谢组学”。严格地说，代谢组学所研究的对象应该包括生物系统中所有的代谢产物。但由于实际分析手段的局限性，只对各种代谢路径底物和产物的小分子物质（MW85%）整体信息15。在代谢组学分析中，常通过PCA得分图（score plot）以获得对样品分类的信息；通过PCA载荷图（loading plot）以发现可作为生物标记物的变量。数据输出的最终目的是将代谢组数据转化为标准化和统一的格式16。分析仪器直接导出的元数据（metadata），由于原始谱图的信号量大、噪音复杂、格式各样、尺度迥异、基线漂移和测试重现性等问题 17 ，不能直接用于模式识别分析，此前须经过原始数据的预处理，如采用多种方法 18，19进行原始图谱的分段积分、滤噪、峰匹配、标准化和归一化等处理，最后提取出二维数据表形式，即行代表样品或试验数目；列表示相应的单个测定指标（通常为信号强度等）。（四）代谢组学应用领域4.1. 代谢组学在医学领域的研究应用代谢组学在医学中的应用主要集中于疾病状态的诊断及疾病发病机制的研究两个领域。由于机体的病理变化，使得机体的代谢产物也产生了某种相应的变化，对这些由疾病引起的代谢产物的变化进行分析能够帮助人们更好地理解病变过程及机体内物质的代谢途径，有助于发现疾病新的生物标志物和辅助临床的诊断。4.1.1 心脏病心脏疾病的研究是代谢组学技术研究最多的病种之一，也是相对较为有成就的病种之一。Brindle等20应用1H-NMR技术，以血清与血浆为研究对象，对36例严重心血管疾病患者（TVD）和30例心血管动脉硬化患者进行谢组学研究，结合主成分分析（PCA）等模式识别技术对心血管疾病及其严重程度进行判别，得到了高于90%的灵敏度及专一性。该方法具有最小限度的侵入性，仅需几滴血液，利用核磁共振分析，然后再以计算机模式识别技术加以分类，就可以区分出心脏病前兆的核磁共振图谱特征模式，优于传统的心血管造影术，用于心血管检测具有快速、廉价、安全的优点，且不良反应少。而且检测标本(可以是血液、尿液等)无须特殊的前期处理，可以有效地应用于人群的筛查。Kostar等21用1H-NMR对已经确诊为冠心病的病人全血浆的脂质进行了分析。他们认为目前严重的冠心病患者都伴随有原生质脂蛋白的改变。1H NMR是一种能够提供快速全面的分析脂质混合物的新方法，而且这种方法不需要化学变化或试验条件的预处理，对含氢的化合物均有响应，能对代谢产物大多数化合物进行检测，定量容易，分析方法更加简便快捷。4.1.2 癌症癌症是世界最难以攻克的疑难杂症之一，早期发现、早期预防、早期治疗是治疗癌症的最有效方法。沈朋等22研究了乳腺癌患者血清蛋白质和尿代谢物组的变化，发现了乳腺癌患者体液内化学物质与正常人相比特异性模式差异，Beckonert等23用1H NMR方法观测了乳腺癌组织中代谢产物的改变。研究发现，活体外NMR技术结合适当的模式识别和可视化技术可以通过对组织匀浆代谢产物的检测区分不同的组织。研究发现，通过对组织不同代谢谱图的分析，可以区分不同恶性程度的乳腺肿瘤组织和健康的乳腺组织。4.1.3 高血压原发性高血压中医辨证分为肝火亢盛、痰湿雍盛及阴虚阳亢三型，LU Yi-hong等24应用GC/MS测定健康人及原发性高血压病人血清内源性代谢物，并用主成分分析(PCA)、偏最小乘方分析（PLS-DA）和马氏距离（MD）分析他们的代谢谱。PCA和PLS-DA分析的结果表明：健康人与高血压病人血清代谢谱有明显差异，能够被区分开，而且利用MD不仅可以清晰地区分上述三种类型的高血压，同时还显示高血压的发展过程。除此以外，代谢组学还参与了糖尿病、脂肪代谢类疾病、肾脏疾病等其他疾病等都得到广泛的研究25，26，结果都显示了一定的优越性。4.2 代谢组学在药学领域的研究应用代谢组学与药物药效及毒物毒理的筛选和评价、作用机制研究和个性化治疗用药等均密切相关，在药学领域中有着广泛的应用27。4.2.1在药物毒物作用机制中的应用药物对疾病的治疗作用应该是使机体代谢网络中的不正常部分正常化，同时又不干扰其他的代谢途径。而药物作用机制研究的是药物在体内起什么作用和如何起作用。代谢组学通过研究服药后体内内源性代谢物的变化，直接反映出机体内生物化学过程和状态的变化，探索代谢指纹图谱变化的原因，进而阐明药物作用靶点和过程，揭示药物作用机制。毒物作用机制的研究就是研究毒物在毒性损伤中所起的作用及其如何发挥作用。传统的毒理学实验既耗时又难以确定毒物作用机制，而通过某种代谢物变化的特征作为一种特定指纹来判断毒物作用机制，可以弥补传统研究方法的不足。代谢组学技术应用于毒性作用机制研究，其基本原理是毒性破坏正常细胞的结构功能，改变代谢途径中内源性代谢物稳态，从而通过直接或间接效应改变细胞体液成分。生物体液的谱图中所检测到的是成百上千种代表着不同代谢路径的化合物，正是这些对机体改变和损伤的代谢层面上的信息才能很好地表征这种改变和损伤。用代谢组学方法揭示的生物化学变化很容易与传统手段的测定结果相联系，更容易发现药物作用的生物化学物质基础和作用机制。彭双清等28以引起肝脏毒性损伤的药物异烟肼（INH）和利福平（RFP）为研究对象。代谢组学研究结果表明，3个给药组从第1天起其代谢轨迹就明显偏离对照组和给药前的代谢成分，14天的代谢轨迹均能明显地与对照组的轨迹分开，说明3个给药组的代谢成分都发生了明显改变，3种处理方式对肝脏的损伤存在不同的毒性机制。对尿液1HNMR图谱分析、主成分分析和模式识别发现，INH组中出现柠檬酸盐、琥珀酸盐、葡萄糖和马尿酸盐代谢成分明显降低而氨基已磺酸增高。RFP组中出现柠檬酸盐、马尿酸盐和2-氧戊二(2-oxoglutarate)的降低。合用组中出现柠檬酸盐、琥珀酸盐、马尿酸盐和2-氧戊二酸代谢成分的降低而氨基已磺酸增高。这些代谢成分的改变说明INH组和合用组出现了典型性肝脏损害（氨基已磺酸增高），而且各给药组影响了能量代谢中的三羧酸循环，糖酵解途径发生了改变。INH与RFP合用肝毒性增加不仅与过氧化反应增加有关，而且还与RFP增加细胞色素P450和P4502E1活力有关。代谢组学技术能够很好区分出机体的不同中毒状态，根据不同的代谢表型能够区分出不同药物的毒性作用机制。4.2.2药物安全性评价和在新药研发中的应用药物安全性评价即预测药物的毒性，用于提供药物对人体危害程度的科学依据29。LIU CX30指出基于单个靶点的传统药物开发已走进死胡同，一个药物的开发时间长达1012年，耗资也从原先34亿美元增加到目前的8亿美元。药物开发需要新思维，代谢组学正是这种新思维产生的新技术手段，已逐步被应用于新药研究开发中。它可以对生物体给药后的整个生化反应过程进行检测，考察药物的药效和毒性与各代谢产物的浓度及其动态变化之间的相关性，综合分析代谢产物的变化特点及规律，全面评价药物的价值和开发前景。现在国外很多大的制药公司如礼来，辉瑞等与帝国理工学院合作，利用代谢组学技术对候选药物筛选，极大地减少了药物研发时间与成本，显示了代谢组学在药物研发上的优势。4.2.3 代谢组学对个性化药物治疗的重要性31药物基因组学、转录组学和蛋白组学均可能对个性化药物治疗有帮助，但均存在局限性。对药物基因组学而言，因为基因的复杂性，对人类的研究中很难确定遗传型为表现型还是基因型。一种DNA试验不能提供每个病人完全确定的药物反应。转录组学通常运用互补脱氧核糖核酸(cDNA)表达微阵列来研究基因转录，在个性化药物治疗中不起主要作用。蛋白组学研究由基因组编码的蛋白，它与转录组学一样都存在测定资源的有限性。未来的研究中蛋白组学可能有助于研究者区分一定的蛋白特征从而预测药物的有效性和不良反应。将蛋白组学与代谢组学结合起来有可能实现基因组学的个性化药物治疗。代谢组学主要研究多细胞系统的代谢特征，补充代谢组学则研究单个细胞或者几个细胞的代谢产物。代谢物组代表了即时的体内外的刺激物的总和分析，其价值在于，内科医生可根据病人的表型来分析病人的病程并制定治疗方案。因此药物代谢组学在个性化药物治疗和其他医学方面有很大的发展空间。（五）代谢组学与中药现代化中医药学是我国传统优秀文化的灿烂结晶，数千年来，为中华民族的繁衍昌盛做出了卓越贡献。在人类与疾病做斗争的过程中，中医药以其独特的理论体系和实践经验，充分展示了其安全有效、防病治病的作用。在科技发展日新月异的信息社会，中医药仍以其独特的理论和实践在世界医林中占有一席之地。药材的使用多为复杂的混合物体系，如何对其质量进行有效控制和探明其作用的机理是传统中医药现代化研究面临的重大挑战。近年来随着系统生物学研究的不断深入和发展，其中特别是代谢组学的高通量、整体性的研究技术和研究思路，对中药方剂中活性物质的分析方法及其代谢产物的药代动力学分析提供了新思路和新方法。代谢组学的研究思路，将为从现代科学的基础上解释中药的整体作用机制提供新方法，而代谢组学的研究成果，则可能为建立新型的基于代谢组学的中药药效评价的技术平台做出贡献。5.1 中药现代化中医的“证”是辨证论治的起点和核心，辨证综合了产生病变的各方面（包括当时的气候和环境情况）因素和条件，并结合个体体质、疾病发生的不同阶段和表现，判定为不同的证，从而采用不同治法，通过合理配伍、适时调整药量而达到治疗效果。由于每一个证候都有其外象（外候）与内涵，而外候是用四诊-望、闻、问、切所获得的信息进行整理而得，很难量化，即使用流行病学方法加以分析，亦是靠专家经验打分，最多亦只是半定量。这种诊治的准确性很大程度上依赖医生的诊疗经验。而代谢组学正具备反映和解决这些问题的“组”、“群”、“谱”集成的分析功能。它能够通过检测不同时间患者的尿液或血液，对这些代谢产物进行分析。代谢组学能够帮助人们更好地理解病变过程及机体内物质的代谢途径和代谢状况，还有助于疾病生物标记物的发现和辅助诊断，使诊断、治疗达到个体化。其准确性依赖于仪器的性能，可以提高诊治的科学化、定量化，避免了人为因素的误诊。 中药运用中医阴阳平衡理论和扶正祛邪等理论，合理配伍，从整体上治疗许多疑难疾病。作为一个复合体系，多是配方使用，作用靶点多，涉及多个基因和细胞，从整体上调节人体的平衡和内环境的稳定。中药既需要研究单味药及复方中各化学成分的理化性质及生物活性，又需要研究化学成分间的反应规律及与人体作用的靶系统和其协同作用方式。西方医学对中药复方的研究方法往往是采用“解剖麻雀”的方法，拆方试验，以期最终找出作用明确的活性成分，但其不能反映方剂中药物的君、臣、佐、使配伍规律，整体性作用机制很难在单一机制的药理模型和分子水平上加以诠释。因此，中药要想继续保持强大的生命力，不能仅停留在提取、提纯有效成分的水平上，应该以中医药理论为指导，借助现代生物医学的研究方法，对中药进行全方位的研究，采用的方法有别于西药研究的方式，上升到对中药系统性的研究，以建立一个全新的与现代学科同质的理论体系32。系统生物学的一个最基本想法是要把孤立在基因水平、蛋白质水平的各种信息相互作用，使各种代谢、调控途径及基因网络之间的所有功能模块和系统都联系整合起来，用以说明生物整体。应用代谢组学和系统生物学策略研究疾病及其治疗过程与中医药的整体观念和辨证论治思维不谋而合，即二者均把人体作为一个完整系统来研究。如果利用系统生物学的方法研究中药的科学内涵，有助于译释中医理论的科学依据，势必会促进中医药学的发展，推动中医中药国际化的进程。5.2 代谢组学应用于中药研究我国研究者敏锐地感觉到将代谢组学技术溶入中医药现代化研究领域具有重要的发展前景，中药（尤其是复方）的整体性作用机制和疗效在系统代谢组学的研究方法下将可能得到充分的展示和挖掘。罗和古等对大鼠肝郁脾虚证的代谢组学研究发现醋酸、乳酸、LDL、酪氨酸与三羧酸循环能量代谢、糖酵解及脂肪和蛋白质代谢途径密切相关，上述内源性代谢物的改变提示动物能量代谢及脂肪、蛋白质代谢功能异常，这与已知的应激状态动物体内代谢的调节过程及结果相一致。分析这些内源性代谢产物的形成、转移机制和过程，可提示肝郁脾虚证的发生发展的潜在原因，从而揭示其生物学本质33。陆益红等以代谢组学研究自发性高血压大鼠血浆及人参总皂苷作用机制。从代谢组学的研究结果看：人参总皂苷对SHR作用，体现了中药的多组分、多靶点效应，其作用方式与单靶点西药卡托普利不同，故两者的代谢谱各异。尽管卡托普利降压作用强，但整体改善疾病内环境可能不及人参总皂苷。与经典的血压指标测定、常规的临床生化检测及组织病理学检查相比，代谢组学分析具有多种过去的检验方法无法比拟的优势34。蒋宁等35应用代谢组学方法研究研究快速老化模型小鼠（senescence accelerated mice，SAM）的快速老化亚系SAM-prone /8（SAMP8）及同龄抗快速老化亚系SAM - resistance /1（SAMR1）代谢产物的差别，并观察六味（LW）及八味地黄汤（BW）对SAMP8代谢产物的影响，比较二方剂的作用机理，以12月龄雌性和雄性SAMR1及SAMP8为动物模型，灌胃给予LW和BW 1个月后采集血清，应用核磁共振方法测定核磁共振谱，检测血清中的代谢产物，主成分分析法处理代谢组学数据。结果显示SAMR1和SAMP8的血清代谢产物谱能够相互区分，其中SAMP8血清中的乳酸、极低密度脂蛋白、饱和脂肪酸和甘油三脂含量明显高于SAMR1，葡萄糖、磷脂酰胆碱和胆碱、不饱和脂肪酸、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的含量明显低于SAMR1。给予LW和BW后均可影响SAMP8的血清代谢产物谱，SAMP8的代谢状态得到了很大改善。给予LW后，SAMP8血清代谢物中葡萄糖的含量有了明显的增加，胆碱和低密度脂蛋白的含量有所升高；极低密度脂蛋白的含量则有所减少。给予BW后，SAMP8血清代谢物中葡萄糖和磷脂酰胆碱的含量明显升高，而胆碱含量则较低。表明SAMR1和SAMP8的血清代谢产物谱存在明显差异，主要在于乳酸、葡萄糖、磷酸胆碱和胆碱及脂类含量的差别。SAMP8可能存在糖酵解代谢障碍，葡萄糖代谢下降而引起的能量代谢障碍，胆碱能代谢低下及脂类代谢紊乱。给予LW和BW均能够对SAMP8的血清代谢产物产生影响，提示LW和BW能够在代谢网络的多个节点上对SAMP8的代谢紊乱起到调节和改善作用。这些LW和BW的反应代谢产物为深入研究LW和BW的作用机制及肾阴虚、肾阳虚的现代生物学基础提供了新的线索和依据。李伶36基于核磁共振的代谢组学技术方法研究了附子及其主要毒性生物碱对大鼠体内代谢谱的影响，分析了其毒性特征，并探讨了代谢组学在中药安全性研究中的应用前景。研究表明，采用代谢组学方法能够对附子及其主要毒性生物碱对大鼠的代谢变化的影响进行很好的表征和描述，能够对其毒性作用进行说明。试验结果也表明代谢组学技术用于中药毒性评价具有良好的应用前景。黄玉荣等 37采用代谢物组学方法研究钩藤多动合剂（简称多动合剂）的药效作用及其治疗儿童多动症的生化机制，观察药物对小鼠脑内神经递质的影响。采用攀爬实验和自发行为实验研究多动合剂对去水吗啡小鼠模型的药效作用，同时用高效液相色谱-电化学检测方法研究其生化机制，观察药物对小鼠脑内及血浆中单胺类神经递质多巴胺（DA）和去甲肾上腺素（NE）的影响。从而发现了具有疗效的生物标记物，认为药物的整体作用所产生的生物化学物质（神经递质）是其药效的基础物质，证明多动合剂的作用机制与受体有关。Minjun Chen38等通过给大鼠注射氢化可的松造成类似中医临床“肾阳虚”证的大鼠动物模型利用代谢组学技术进行了研究。为了监测大鼠代谢网络表达水平变化，研究人员分别收集各实验组大鼠尿样，在样品衍生化后运用GC-MS联用方法测定尿样中内源性代谢物的组成，所收集的分析数据输入软件而后采用多元统计分析等计算方法考察。研究表明，与对造组相比肾阳虚状态大鼠的代谢网络明显偏离正常范围。随着系统生物医学的崛起和对代谢组学研究思想的了解，生命科学的多个领域都逐渐参与到代谢组学的研究中来。代谢组检测技术、代谢组学数据的生物信息学和统计学方法的进一步创新，对疾病状框下机体内源物质代谢谱和药物作用代谢谱的分析中可能会发现更多更灵敏的预示疾病或疗效或毒性的生物标记物，甚至是生物标记物组，人们对中药药效和和作用机制的认识可能出现快速的发展。代谢组学这门新兴学科，在药物作用靶点的发现、新药的开发、毒理学研究、疾病的预防和诊断等方面的重要性越来越明显。它是一种较全面系统的研究技术，在方法学上具有融整体、动态、综合、分析于一体的特点，符合中医整体性原则。中医病证引起代谢物组的共性分析和生物标记物的发现，可促进“证”本质的研究、中医辨证的科学化和定量化，深层次理解中医脏象理论，预测疾病的发生，反应肠道内生态环境状况，整体性评价中药复方综合疗效、安全性和作用机制，阐明中药的效应物质基础，建立科学的中药质量控制方法，确保临床中药产品的安全、有效。代谢组学和中医药学的有效组合，进一步加快中医药学研究的现代化进程，必将加快融入世界的步伐。（六）展 望代谢组学作为生命科学研究的有力工具，自提出之日起就备受关注，它运用先进的分析检测技术对生物样品中所有的小分子物质进行检测，结合模式识别、专家系统等分析计算方法对所得代谢组学数据进行处理，最后通过综合解析这些信息来从整体上探讨生命活动在代谢层面上的特征和规律。它不仅为药学、毒理学的研究做出了巨大贡献，还为疾病研究和诊断提供了新的方法和手段。随着系统生物学、 微电子学、分析化学等学科的不断发展，用于代谢组学研究的仪器分析技术和数据处理技术都在不断提高。代谢组学研究的技术平台的不断提高和研究方法的不断改进，使其研究范围也在不断扩大，现在代谢组学技术不仅用于血液、 尿液、体液的代谢物组研究还用于各种组织的代谢产物组研究，同时运动医学、 中医药学、基因组学、营养学、食品科学等其他学科也开始借助代谢组学方法开展相关研究。 此外，代谢组学与基因组学、蛋白质组学的联合使用以及不同分析技术、不同生物样品的联 合应用更使代谢组学向真正的系统、综合、全面的目标迈进。未来代谢组学研究的需要技术和方法学的原始性创新，需要学科交叉和多维技术联用基本理论研究，科学实验和测量方法、技术和设备整体平台的提升，包括新型的复杂样品处理技术；快速、灵敏、专一、原位、动态、无损的代谢物组检测、表征与操纵技术；获取代谢物质组成、结构和功能信息的新型表征技术和完整的数据采集和成像系统；有效、快速处理代谢组海量复杂数据的新化学信息学方法。制定代谢组学工作标准（包括方法、信息和数据库），整合代谢组、基因组、转录组和蛋白质组数据、构建系统生物学知识库、分析生物标记物的结构与功能、阐明相关生化机制（如药理、毒理等）和生命现象，获得对生命过程的定量研究和复杂生物网络的系统认识，是代谢组学的重要研究趋势。.