实验4-琼脂糖凝胶电泳检测DNA.ppt

实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA,一、实验目的,通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术，检测上次实验课提取的质粒DNA,二、实验原理,带电物质在电场中的趋向运动称为电泳。凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为蛋白质、核酸研究的首选标准方法泳动率是带电颗粒在一定的电场强度下，单位时间内在介质中的迁移距离。泳动率与样品分子所带的电荷密度、电场中的电压及电流成正比，与样品的分子大小、介质黏度及电阻成反比。不同大小的带电分子具有不同的泳动率，在不同的介质条件下又具有不同的分辨效率影响泳动率的因素包括样品的物理性状、支持物介质、电场强度和缓冲液离子强度DNA的凝胶电泳常使用两种支持介质：琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶,关于电泳,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应在碱性缓冲液中DNA分子带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型琼脂糖凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子可以分离长度为100bp至近60kb的DNA分子，常采用TAE、TBE和TPE三种缓冲体系,质粒DNA分子有三种构型:CCDNA(共价闭合环状DNA:两条核苷酸链均保持着完整的环形结构，DNA呈现超螺旋)、OCDNA(开环DNA：质粒的一条链断裂)LDNA(线形DNA：质粒的两条链均断裂)，这三种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的泳动率不同，因此电泳后呈三条带，CCDNA泳动最快，其次是LDNA，最慢的是OCDNA,电泳方向,EB：即溴化乙锭，它能够插入DNA分子中的碱基对之间而与DNA结合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧光，易于检测。可以检测10ng的DNA注意：EB是一种诱变剂，操作时一定要注意安全，必须戴塑料或乳胶手套,GoldView:是一种可代替EB的新型核酸染料，采用琼脂糖电泳检测DNA时，GoldView与核酸结合后能产生很强的绿色荧光信号，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，而且也可用于染RNA。,DNA的染料,线性DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度的关系,聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵和加速剂TEMED的作用下聚合而成可以分离小片段（5500bp）DNA分子聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用：蛋白质分子的分离鉴定蛋白质分子量的测定核酸的分析核酸序列测定,在pH值为8.0-8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的琼脂糖凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。,实验原理,三、仪器、材料与试剂,微波炉琼脂糖凝胶电泳系统紫外线透射仪质粒DNADNAmarker50TAE6凝胶加样缓冲液琼脂糖1溴化乙锭溶液,四、实验步骤,1.装好制胶装置用胶带将洗净、干燥的制胶板两端封好(一定封严，不能留缝隙),使用水平仪，将胶板调至水平，插入适当梳子2.将1g琼脂糖加入100ml1TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解（冷却到60，加入5l的1EB，并摇匀），则为1琼脂糖凝胶液3.将溶解的琼脂糖（约50）倒入，室温冷却凝固4.充分凝固后小心垂直向上拔出梳子，撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中(注意：DNA样品孔应朝向负电极一端)，加1TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶0.5cm,5.用移液器吸取质粒样品5l于封口膜上，再加入1l的6加样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔(记录电样的顺序和电样量)6.打开电源开关，调节电压至35V/cm，可见溴酚蓝条带由负极向正极移动(注意DNA片段从负极向正极移动)7.当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿12cm处，停止电泳8.将凝胶置于紫外线透射仪上，打开紫外灯，DNA存在处显出桔红色荧光条带（注意：紫外线对眼睛有伤害作用，应戴上防护眼睛）,每班4组，约30人每组7人：1套琼脂糖凝胶电泳系统（电泳槽、电泳仪、制胶板、有机玻璃槽、8孔梳子），20L或10L移液枪1支，冰盒1个，50mL锥形瓶1个（贴上EB标签）。每班配2台电炉，线手套2副。,实验分组,五、思考题,EB的中文名称是什么？使用EB时应注意些什么？怎么制备一块20mL体积1琼脂糖凝胶（含溴化乙锭溶液终浓度0.5g/mL）？什么是LoadingBuffer？LoadingBuffer中含有哪些成分？各组分的作用是什么？,1倒胶时把握好胶的温度，不要高于60，否则温度太高会使制板变形2胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔3点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多4EB有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔5紫外线照射不要太久,注意,凝胶电泳槽,