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第2节基因工程的操作程序,1.说出基因工程的操作程序。2.记住获取目的基因的方法。3.记住将目的基因导入受体细胞的方法。4.说出目的基因的检测和表达产物的测定方法。,一,二,三,四,一、目的基因的获得1.目的基因是指人们所需要的进行研究的基因。2.目的基因获取的方法主要有两种:化学合成法和从基因组中直接分离法。3.化学合成法是指利用化学反应直接合成基因。该方法主要适用于已知核苷酸序列的、相对分子质量较小的目的基因的制备。4.从基因组中直接分离法是目前获得目的基因的主要手段。5.由于真核生物基因组较大,分离目的基因时,往往要根据已获得的信息,采用很多综合的分子生物学技术,如利用DNA扩增仪(PCR仪)直接扩增目的基因;也可以利用反转录法,以mRNA为模板,借助反转录酶,通过PCR仪合成与mRNA序列互补的DNA片段,然后在聚合酶的作用下合成双链DNA,从而获得所需要的目的基因。,一,二,三,四,二、基因表达载体的构建1.大肠杆菌质粒DNA的提取:最常用的方法是碱裂解法。2.基因表达载体的构建:以质粒为例,首先要用限制性内切酶切割质粒,使环状质粒出现一个切口,露出DNA末端,然后用同样的限制性内切酶去切割目的基因,使目的基因暴露出同样的DNA末端。在DNA连接酶的作用下,将有切口的质粒与同样末端的目的基因连接在一起,形成含有目的基因的新的环状质粒DNA分子表达载体。3.除了利用质粒作运载体外,还可以用病毒作运载体。因为病毒很容易接近寄主细胞,人们把病毒的DNA分子进行改造,将病毒的有害基因去掉,换上目的基因,这样经过改造的病毒DNA分子用蛋白质“包装”之后,很容易地将目的基因送进寄主细胞中。,一,二,三,四,思考：基因工程的核心步骤是什么?在此操作中用到哪些工具酶?提示:基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。在此操作中要用到限制性内切酶和DNA连接酶两种工具酶。,一,二,三,四,三、目的基因的导入1.将目的基因导入受体细胞的方法有:花粉管通道法、氯化钙法、农杆菌介导的遗传转化法、基因枪法以及电击法、聚乙二醇法等。2.花粉管通道法花粉管通道法是指外源基因利用植物受精后花粉萌发形成的花粉管通道进入受体细胞,借助天然的种胚系统形成含有目的基因的种胚。3.氯化钙法如果运载体是质粒,受体细胞是大肠杆菌,最常用的遗传转化技术是氯化钙法。这一方法也是扩增表达载体的常用方法,受体细胞经过一定浓度的氯化钙处理后,细胞膜的通透性会发生变化,可以允许含有目的基因的运载体分子进入感受态细胞。,一,二,三,四,4.农杆菌介导的遗传转化法(1)农杆菌是一种土壤细菌,它侵染植物细胞后,会使植物组织形成肿瘤。农杆菌中存在一种环形的Ti或Ri质粒,质粒上的T-DNA可插入植物基因组引起植物细胞的变化。由于T-DNA转移频率很高,而且Ti质粒上可插入几百至几千个碱基大小的DNA片段,因此可以利用这种天然的遗传转化体系,将目的基因转移到植物细胞。(2)优点:转化频率高、成本低、操作简单,而且转基因后代的遗传组成比较容易分析。5.基因枪法把细胞看成靶子,用基因枪装上带有目的基因的微弹,对植物细胞进行轰击,目的基因便像子弹一样,随着基因枪的强烈轰击,进入到受体细胞中。,一,二,三,四,四、目的基因的检测与表达产物的测定1.形态检测(1)如果目的基因的表达产物具有明显的表型性状,那么,可以根据目标性状的有无来判断目的基因是否表达。(2)如果目的基因的产物没有明显的表型,在构建表达载体时,通常把一个报告基因与目的基因连在一起,通过检测报告基因的表达情况,来检测目的基因的表达;所用的报告基因通常是抗生素抗性基因或荧光标记基因。通过检测受体细胞是否具有某种抗生素的抗性,或是否具有某种荧光标记,来追踪目的基因的表达情况。,一,二,三,四,2.分子检测(1)PCR检测:根据目的基因的序列设计引物,采用PCR技术对目的基因进行扩增,如果能扩增出目的基因片段,说明目的基因已整合到受体细胞中。(2)分子杂交检测:把目的基因片段进行放射性同位素标记或进行生物素荧光标记,用标记好的基因片段作探针,与受体生物的基因组DNA进行杂交,如果有杂交斑点,根据分子杂交的基本原理,说明目的基因与受体细胞基因组DNA具有同源性,也就是说目的基因已经被导入受体细胞内,反之,则说明目的基因没有进入受体细胞中。(3)目的基因是否表达的检测:提取目的基因mRNA,检测目的基因的转录情况;分离目的基因编码的蛋白质,检测目的基因的表达情况。,1.基因表达载体的构建(1)构建过程,(2)构建目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代,同时,使目的基因能够表达和发挥作用。,特别提醒终止子是指DNA分子上决定转录终止的一段核苷酸序列;终止密码子是指mRNA分子上决定翻译终止的三个相邻的碱基。,2.将目的基因导入受体细胞常用方法的比较,3.目的基因的检测与鉴定过程,题型一,题型二,题型三,题型四,基因工程技术的操作【典例1】天然的玫瑰没有蓝色花,这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B,而开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B。现用基因工程技术培育蓝玫瑰,下列操作正确的是()A.提取矮牵牛蓝色花的mRNA,经反转录获得互补的DNA,再扩增基因BB.利用限制性内切酶从开蓝色花矮牵牛的基因组中获取基因BC.利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞D.将基因B直接导入大肠杆菌,然后感染并转入玫瑰细胞,题型一,题型二,题型三,题型四,解析:由题意知,控制蓝色色素合成的基因B是目的基因,提取矮牵牛蓝色花的mRNA,经反转录获得互补的DNA,再扩增基因B,即得到目的基因B,A项正确。限制性内切酶是将某DNA分子上的目的基因切割下来,而不是获取目的基因,B项不正确。将目的基因B与质粒连接需用DNA连接酶,而不是DNA聚合酶,C项不正确。基因B需与质粒连接形成基因表达载体再导入农杆菌,然后感染并转入玫瑰细胞,而不能将基因B直接导入大肠杆菌,D项不正确。答案:A,题型一,题型二,题型三,题型四,基因表达载体的构建【典例2】下列有关基因表达载体构建的说法,不正确的是()A.需要限制性内切酶和DNA连接酶参与B.基因表达载体中含有启动子和终止密码子C.通常用抗生素抗性基因作为报告基因D.基因表达载体的构建是基因工程的核心解析:基因表达载体的构建关系到目的基因在受体细胞中能否表达,是基因工程的核心。基因表达载体的构建需要限制性内切酶和DNA连接酶参与,它的结构由目的基因、启动子、终止子、标记基因等组成。终止密码子是指位于mRNA上的不编码氨基酸的三个相邻碱基,是翻译结束的位点,而终止子是位于DNA上三个相邻的碱基,它是转录结束的位点。答案:B,题型一,题型二,题型三,题型四,反思领悟表达载体是在原始载体(如天然质粒)的基础上,插入表达系统,如启动子、终止子和标记基因等,使其在受体细胞内既易于表达又易于检测。,题型一,题型二,题型三,题型四,目的基因的导入【典例3】采用基因工程的方法培育抗虫棉,下列导入目的基因的做法正确的是()将毒素蛋白注射到棉受精卵中将编码毒素蛋白的DNA序列,注射到棉受精卵中将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组后导入细菌,用该细菌感染棉的体细胞,再进行组织培养将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组,并配制成一定浓度的溶液,然后涂抹人工授粉后的棉花柱头A.B.C.D.,题型一,题型二,题型三,题型四,解析:将目的基因导入受体细胞时,要通过限制性内切酶和DNA连接酶将目的基因和运载体结合起来,然后导入受体细胞。将毒素蛋白直接注射到棉受精卵中,没有获得目的基因,子代细胞不会有抗虫性状。将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中而没有将目的基因与运载体结合,这样目的基因在细胞内很容易被水解,不能保留下来,更不能表达。答案:C,题型一,题型二,题型三,题型四,目的基因的检测与表达产物的测定【典例4】运用现代生物技术,将苏云金杆菌的抗虫基因整合到棉花细胞中,为检测实验是否成功,最方便的方法是检测棉花植株是否有()A.抗虫基因B.抗虫基因产物C.新的细胞核D.相应的抗虫性状解析:对目的基因的检测有形态检测和分子检测。相对来说分子检测操作难度大,而形态检测直观且简单,如用棉花叶片饲喂棉铃虫,观察棉铃虫是否死亡即可。答案:D,1,2,3,4,5,1.在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中,下列操作错误的是()A.用限制性内切酶切割烟草花叶病毒的核酸B.用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和运载体C.将重组DNA分子导入烟草原生质体D.用含除草剂的培养基筛选抗除草剂的转基因烟草细胞解析:构建重组DNA分子时,需用限制性内切酶切割目的基因和运载体,再用DNA连接酶连接形成重组DNA分子。烟草花叶病毒的遗传物质是RNA,限制性内切酶只能识别和切割有特定序列的DNA分子,同时该过程的目的基因是抗除草剂基因,A项错误。答案:A,1,2,3,4,5,2.下列不属于目的基因与运载体结合过程的是()A.用一定的限制性内切酶切割质粒露出黏性末端B.用同种限制性内切酶切割目的基因露出黏性末端C.将切下的目的基因的片段插入质粒切口处D.将重组DNA导入受体细胞进行扩增解析:将重组DNA导入受体细胞进行扩增,是在完成目的基因与运载体结合过程之后。答案:D,1,2,3,4,5,3.目的基因导入受体细胞后,是否可以稳定维持和表达其遗传特性,只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是()检测受体细胞内是否有目的基因检测受体细胞是否有质粒检测目的基因是否转录形成mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质A.B.C.D.解析:目的基因的检测与表达产物的测定有分子水平上的检测,如目的基因是否导入受体细胞,目的基因是否转录形成mRNA,目的基因是否翻译成蛋白质;还有个体水平上相应性状的鉴定,如抗虫、抗病性状等。但是受体细胞内有质粒不代表一定有目的基因。答案:C,1,2,3,4,5,4.下列一般不作为基因工程中的报告基因的是()A.四环素抗性基因B.绿色荧光蛋白基因C.产物具有颜色反应的基因D.贮藏蛋白的基因解析:报告基因位于运载体(质粒)上,通常用于检测目的基因的表达情况,如四环素抗性基因、绿色荧光蛋白基因、产物具有颜色反应的基因等。答案:D,1,2,3,4,5,5.科学家利用基因工程技术可以使哺乳动物本身变成“批量生产药物的工厂”。目前科学家已在牛和羊等动物的乳腺生物反应器中表达出了抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素等重要药品。请回答有关问题。(1)将药用蛋白基因和乳腺蛋白基因的启动子、终止子和等重组在一起,就可构建基因表达载体,再通过技术即可导入受精卵中。(2)为确定受体细胞中染色体上是否插入了目的基因,可利用技术进行检测,一般是用放射性同位素标记作探针。(3)转化成功的受精卵发育成胚胎需要进行体外培养,在培养液中要加入等天然成分。,1,2,3,4,5,解析:基因表达载体的组成,除了目的基因外,还必须有启动子、终止子及标记基因。显微注射技术是转基因动物操作中采用最多、也最有效的方法。将含有目的基因的DNA片段用放射性同位素标记作探针,用DNA分子杂交技术可检测目的基因是否成功插入到受体细胞染色体上。答案:(1)标记基因显微注射(2)DNA分子杂交含有目的基因的DNA片段(3)血清,
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