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第十单元现代生物科技专题第38讲微生物的利用,考纲要求(1)微生物的分离和培养(2)某种微生物数量的测定(3)培养基对微生物的选择作用,教材导学一、微生物的分离和培养1.培养基(1)概念：人们按照微生物对_的不同需求，配制出供其_的营养基质。(2)营养构成：一般都含有_和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对_、氧气以及_的要求。(3)种类：按照物理性质可分为_培养基和固体培养基。,2.无菌技术(1)含义：指在培养微生物的操作中，所有防止_的方法。(2)关键：防止_的入侵。,(3)不同对象的无菌操作方法连线,3.大肠杆菌的纯化培养(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基：计算_溶化_(2)纯化大肠杆菌的方法：纯化培养原理：想方设法在培养基上得到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的菌落，即可获得较纯的菌种。纯化大肠杆菌的关键步骤：_。,常用的微生物接种方法有两种：a.平板划线法：是通过接种环在琼脂固体培养基表面_，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。b.稀释涂布平板法：是将菌液进行一系列的_，然后将_的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。(3)菌种的保存方法：对于频繁使用的菌种，可以采用_的方法。对于需要长期保存的菌种，可以采用_的方法。,二、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数1.分离原理土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成_，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到_作用。2.统计菌落数目统计样品中的活菌一般用_法。3.实验流程土壤取样_微生物的培养与观察细菌的_。,(2)筛选方法：_染色法，即通过是否产生_来筛选纤维素分解菌。(3)培养基：以_为唯一碳源的选择培养基。(4)实验流程：土壤取样：富含_的环境,选择培养：用_培养，以增加纤维素分解菌的浓度_：制备系列稀释液涂布平板：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生_的菌落,自我校对一、1.(1)营养物质生长繁殖(2)水、碳源、氮源pH特殊营养物质(3)液体2.(1)杂菌污染(2)外来杂菌(3)ba3.(1)称量灭菌倒平板(2)接种连续划线的操作梯度稀释不同稀释度(3)临时保藏甘油管藏二、1.脲酶催化2.稀释涂布平板3.样品的稀释计数三、1.(1)复合酶C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶(2)纤维二糖葡萄糖2.(1)红色复合物透明圈(2)刚果红透明圈(3)纤维素(4)纤维素选择培养基梯度稀释透明圈,2.培养基的组成成分一般含有水、碳源、氮源和无机盐。(1)自养型生物不加碳源或加无机碳源，异养型生物加有机碳源。(2)固体培养基需加琼脂。(3)天然复杂物质可提供多种营养，如牛肉膏可提供碳源、磷酸盐和维生素。,【例1】(2014广西桂林质检)下列关于微生物培养基的叙述，错误的是()A.制备固体培养基，可以在液体培养基中加入凝固剂琼脂B.微生物在固体培养基表面生长形成的菌落，可以用肉眼观察到C.所有培养基都含有相同的水、碳源、氮源和无机盐等四类物质D.培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素,【解析】培养不同微生物的培养基中所含的碳源等有所不同，如无机碳源或有机碳源。【答案】C,(1)该培养基所含有的碳源有_，其功能是_。(2)该培养基所含有的氮源有_，其功能是_。(3)该培养基除含碳源、氮源外，还有微生物需要的营养物质，是_。(4)用该培养基培养微生物时，还需要控制哪些理化条件？_。,.乙同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验。实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察。请回答与此实验相关的问题。(1)乙同学培养基为_(物理性质)培养基，其中含有的蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供了_和_。(2)对培养基进行灭菌，应该采用的方法是_。(3)为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于_中培养，培养的温度设定在37。要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种_作为对照进行实验。,【解析】本题考查微生物的基本营养、培养条件和培养基的有关知识。应从微生物的代谢特征入手分析培养所需的碳源、氮源的种类和应给与的温度、气体等环境条件。.对异养微生物来说，含C、H、O、N的化合物既是碳源，又是氮源，因此蛋白胨既可作为碳源，又可作为氮源。培养微生物需要控制的理化条件有温度、氧气浓度和pH等。.调查湖水细菌的污染情况，就要计数，用固体培养基；蛋白胨来,源于动物原料，含有维生素、糖和有机氮等营养物质，在培养基中主要是作为氮源。实验室的灭菌方法一般有：灼烧灭菌法(适合于接种工具的灭菌)、干热灭菌法(适合于耐高温的、需要保持干燥的物品的灭菌)、高压蒸汽灭菌法(适合于培养基等物体的灭菌)。要想使微生物快速地繁殖，就要置于适宜的条件下，特别是温度，所以要置于恒温培养箱中，对照实验就要设置一个无菌的加以比较进行观察。,【答案】.(1)蔗糖、乳糖、蛋白胨主要用于构成微生物的细胞物质和代谢产物(2)蛋白胨主要用于合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物(3)水、无机盐(或K2HPO4)(4)温度、氧气浓度等.(1)固体氮源碳源(2)高压蒸汽灭菌(3)恒温培养箱无菌水,【例3】下列关于灭菌和消毒的说法不正确的是()A.灭菌是指杀灭物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子B.消毒和灭菌的条件、结果、方法是相同的C.接种环用灼烧法灭菌D.常用灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌等,【解析】灭菌是指杀灭物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子，消毒只能杀死部分微生物，不能杀死芽孢和孢子。【答案】B,【例4】细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的无菌技术，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌()A.接种环、手、培养基B.高压锅、手、接种环C.培养基、手、接种环D.接种环、手、高压锅,【解析】一般说来灭菌是指彻底杀灭微生物使其永远丧失生长繁殖的能力，对于培养基、操作器皿和接种环等都需要灭菌。消毒仅指杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害，如操作者的手臂需要消毒处理。高压蒸汽灭菌锅是灭菌设备，通常用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物的接种工具，如接种环。【答案】C,【例5】用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目，其结果与实际值相比()A.比实际值高B.比实际值低C.和实际值一致D.比实际值可能高也可能低,【解析】本题考查微生物的计数问题。弄清稀释涂布平板法的原理是正确解答该题的前提。因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，而样品稀释度无论多高都很难使其中的细菌都单个分布于培养基上。【答案】B,【例6】下图是微生物平板划线示意图。划线的顺序为1、2、3、4、5。下列叙述正确的是(),A.在五个区域中划线前后都要对接种环和培养基进行灭菌B.划线操作时完全打开皿盖，划完立即盖上C.接种时不能划破培养基，否则难以达到分离单菌落的目的D.第1区和第5区的划线最终要连接起来，以便比较前后的菌落数,【解析】在每次划线前后都要对接种环进行灭菌；进行划线操作时，左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖；注意接种时不能划破培养基，否则难以达到分离单菌落的目的；第1区和第5区的划线不能相连。【答案】C,考点四微生物的筛选与计数1.筛选菌株(1)原则：人为提供有利于目的菌生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长。,2.统计菌落数目的方法(1)显微镜直接计数法：原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。方法：用计数板计数。缺点：不能区分死菌与活菌。,(2)间接计数法(活菌计数法)：原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。计算公式：每克样品中的菌株数=(CV)M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。,操作：设置重复组，增强实验的说服力与准确性。同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在30-300的平板进行计数。【注意】(1)为了使结果接近真实值，应设置三个或三个以上的平板，计算出菌落平均数。(2)计算时明显偏离实际值(本组实验其他平板计数值)的要舍弃掉后求平均值。(3)对照实验的设计首先要明确设计的目的，分析出实验的自变量之后才能准确设计。,【例7】下列关于微生物分离和培养的叙述，错误的是()A.微生物培养前，需对培养基进行消毒B.测定土壤样品中的细菌数目，常用菌落计数法C.分离土壤中不同的微生物，要采用不同的稀释度D.分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中的唯一氮源,【解析】微生物培养前，需对培养基进行灭菌，而不是消毒；测定土壤样品中的细菌数目，常用菌落计数法；分离土壤中不同的微生物，要采用不同的稀释度，因为不同的微生物在土壤中的含量不同；分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中的唯一氮源。【答案】A,【例8】自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。实验步骤：(1)制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。(2)为了得到更加准确的结果，你选用_法接种样品。,(3)适宜温度下培养。结果分析：(1)测定大肠杆菌数量时，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确可信的是_，其理由是_。A.一个平板，统计的菌落数是230B.两个平板，统计的菌落数是220和260，取平均值240C.三个平板，统计的菌落数分别是210、50和520，取平均值260D.四个平板，统计的菌落数分别是210、300、240和250，取平均值250,(2)一同学在稀释倍数为105的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中的菌落数是_(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL)。(3)用这种方法测定的大肠杆菌比实际活菌数量_，因为_。,【解析】实验步骤：为了得到更加准确的结果，应用稀释涂布平板法接种样品。结果分析：(1)选取多个菌落数相差不大的平板计数，取其平均值。(2)2340.1105=2.34108。(3)因为菌落可能由两个或多个细菌连在一起生长而成，所以实际活菌数量要比测得的数量多。,【答案】实验步骤：(2)稀释涂布平板结果分析：(1)D在设计实验时，一定要涂布至少三个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性；在分析实验结果时，要考虑所设置的重复组的结果是否合理(2)2.34108(3)少当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落,课堂练习1.下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是()A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板B.取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1mL，分别涂布于各组平板上C.将实验组和对照组平板倒置，37恒温培养24-48小时D.确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数,解析本题以“土壤中细菌的计数”为命题点，考查基础知识的识记情况。为减少空气中微生物的污染，应将平板倒置。从基本操作方法和原理入手解答该题。在细菌计数时，为保证实验结果的准确性，应至少涂布三个平板，选择菌落数在30-300的平板进行计数；然后求出平均数，再根据对应的稀释度计算出样品中的细菌数。答案D,2.利用农作物秸秆为原料可生产乙醇，生产过程中可采用微生物将秸秆水解或用酶水解，其主要技术流程如下图所示，下列相关说法错误的是()秸秆碎屑反应罐水解压滤出渣酒精发酵真空分馏,A.可用刚果红染色法筛选过程所需的纤维素分解菌B.过程加入的纤维素酶是葡萄糖苷酶C.酒精发酵接种的酵母菌需在无氧条件下发酵D.酒精发酵前需对培养基进行高压蒸汽灭菌,解析筛选纤维素分解菌可采用刚果红染色法；纤维素酶为复合酶，至少包含三种组分，C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶；酒精发酵需在无氧条件下进行；酒精发酵前需对培养基进行高压蒸汽灭菌。答案B,3.(2012北京)高中生物学实验中，在接种时不进行严格无菌操作对实验结果影响最大的一项是()A.将少许干酵母加入到新鲜的葡萄汁中B.将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上C.将转基因植物叶片接种到无菌培养基上D.将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上,解析将少许干酵母加入到新鲜的葡萄汁中进行酿酒时，在缺氧、酸性环境下其他杂菌不能生长，故不严格灭菌对其影响不大；腐乳制作中将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上，毛霉生长繁殖快且抗杂菌能力强，故不严格灭菌对实验结果影响不大；进行植物组织培养时，植物材料体积小、抗性差，而微生物繁殖快、生长迅速、会争夺培养基中的营,养，产生的代谢废物还会毒害培养材料，故培养材料一旦被微生物(如细菌)污染，将严重影响实验结果；选择培养基中已经加入了某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物生长，另外土壤浸出液本身也含有一定量的微生物，因此将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上时不进行严格的无菌操作，对实验结果影响不大。答案C,4.苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如下图所示，为土壤样品。下列相关叙述错误的是(),A.图中培养目的菌株的选择培养基中应加入苯酚作为碳源B.如果要测定中活细菌数量，常采用稀释涂布平板法C.若图中为对照实验，则其中应以苯酚作为唯一的碳源D.使用平板划线法可以在上获得单菌落,解析本题以“从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株”为载体，考查用选择培养基分离微生物的基本方法。解题时，应从所分离微生物与其他微生物对营养或理化条件的异同、各个实验过程的原理入手进行分析。用苯酚作为选择培养基的特殊的碳源，也是微生物的能源物质，所以会影响其生长。测定培养液中细菌数目多用稀释涂布平板法。若为对照实验，则应含除苯酚外的其他碳源，以苯酚作为唯一碳源。使用稀释涂布平板法或划线法都可以在上获得单菌落。答案C,5.从自然菌样中筛选较理想生产菌种的一般步骤是：采集菌样富集培养纯种分离性能测定。(1)不同微生物的生存环境不同，获得理想微生物的第一步是从适宜的环境采集菌样，然后再按一定的方法分离、纯化。培养噬盐菌的菌样应从_环境采集。(2)富集培养指创设仅适合待分离微生物旺盛生长的特定环境条件，使其数量大大增加，从而分离出所需微生物的培养方法。对产耐高温淀粉酶微生物的富集培养应选择_的培养基，并在_条件下培养。,(3)下面两图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图解，请分析接种的具体方法。获得图甲效果的接种方法是_，获得图乙效果的接种方法是_。(4)配制培养基时各种成分在熔化后分装前必须进行_，接种前要进行_。在整个微生物的分离和培养中，一定要注意在_条件下进行。,解析本题考查微生物的分离、培养、纯化的有关知识。解题时，对菌样采集必须考虑到所分离的微生物的生理特性和相应的土壤特点。培养微生物则要考虑它对营养的需要和对氧气、pH的不同要求。根据图甲和乙不难看出甲和乙的接种方法，配制培养基的步骤包括配制培养基、调节pH、分装、包扎、灭菌、搁置斜面等。答案(1)海滩等高盐(2)以淀粉为唯一碳源高温(3)稀释涂布平板法平板划线法(4)pH调整高压蒸汽灭菌无菌,6.(1)在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑_、_和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、_、_等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。(2)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养器皿进行_(消毒、灭菌)；操作者的双手需进行清洗和_；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能_。,(3)若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的_。(4)通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的_。(5)培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是_。(6)若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及培养物必须经过_处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。,解析(1)大肠杆菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、易培养、生活周期短等优点，培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑温度、酸碱度和渗透压等条件。(2)灭菌是用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，所以对培养基和培养皿进行灭菌；消毒是用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物，操作者的双手需要进行清洗和消毒；紫外线能使蛋白质变性，还能损伤DNA的结构。,(3)稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养，应保证样品稀释的比例适合。(4)对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的鉴定。,(5)培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生。(6)因为有的大肠杆菌会释放毒素，并可能导致肠管出现严重症状，使用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。,答案(1)温度酸碱度易培养生活周期短(2)灭菌消毒损伤DNA的结构(3)比例合适(4)鉴定(或分类)(5)将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生(6)灭菌,
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