PCR原理及检测方法.ppt

PCR原理及检测方法,一、PCR的定义：PCR（polymerasechainreaction)：聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。,PCR技术：1985年由美国Cetus公司的KaryMullis首创，可以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上。优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等，广泛应用于微生物学、考古学、法医学及体育等领域，并已普及到许多普通实验室，大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地对目的基因进行分析、鉴定。KaryMullis本人因此获1993年诺贝尔化学奖。,二、PCR的原理：用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段，类似于天然DNA的复制过程。以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5末端和3末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。,扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合，基本反应步骤分三步：1.变性(Denaturation)：加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链。94302.退火(复性)(Annealling):突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。5530,3.延伸(Extension):将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合酶、4种dNTPs及镁离子等存在的条件下，以引物的3端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNA链。721上述3步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过2540个循环后DNA可扩增106109倍。,PCR扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所决定的。反应初期，原来的DNA担负起使模板的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的片段急剧增多而成为主要模板，最终的扩增产物是介于两种引物5端之间的DNA片段。,三、PCR的成分和作用：1.缓冲液：1050mMTris-Cl(pH8.4)维持Taq酶作用环境的偏碱性2550mMKCl促进引物退火，50mM会抑制Taq酶的活性。100g/ml牛血清白蛋白(BSA)对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作用，建议使用乙酰化的BSA。明胶、Tween-20、二硫苏糖醇(DTT)也有类似作用。,2.MgCl2:1.52.0mMTaq酶具有Mg2+依赖性，显著影响反应的特异性和扩增片段的产量，过量能增加非特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下降。,3.dNTPs:dATP、dGTP、dCTP、dTTP底物0.020.2mMdNTPs可与Mg2+结合，应注意Mg2+浓度与dNTPs浓度之间的关系，Mg2+浓度比dNTPs浓度高0.22.5mM。过高：加快反应速度，还可增加碱基的错误掺入率和室验成本。过低：反应速度下降，可提高实验的精确性。,4.引物(Primer-P)：预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。0.21M偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间形成引物二聚体，产量降低。偏低：产量降低。,5.TaqDNA聚合酶：耐高热0.55U/100l1U/2550l偏高：引物非特异产物的扩增偏低：产物量降低,6.模板DNA(Template):最低102105bpDNA片段，实际用量远远超过此量，用量需在实验中摸索。15l过高：非特异产物增加过低：产量降低7.水：去离子水，补足整个反应体积。,四、PCR反应体系：各种成分的实际用量应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓度进行核算。,五、PCR反应条件优化：1、温度、循环参数：变性温度和时间：保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。加热9095，3060s，再复杂的DNA分子也可变性为单链。根据模板DNA复杂程度，可以调整变性温度和时间。一般情况下选择9430，可使各种复杂的DNA分子完全变性。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。,复性温度和时间：PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度的选择，可根据引物的长度和G+C含量确定，长度在1525bp之间时，复性温度Tm=4(G+C)+2(A+T)计算得到，一般位于4060，3060s。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。一般情况下选择5530，足以使引物与模板之间完全结合。,延伸温度和时间：一般位于Taq酶最适作用温度7075之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到7075。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，1Kb需加长延伸时间，10Kb片段延伸时间可达15分钟。延伸时间过长可出现非特异扩增，常用721。,循环数：其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说2025次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，2030次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。,六、PCR扩增产物的分析常用琼脂糖凝胶电泳,上排：1：marker2：阴性对照3-17：标本（引物为CA16）下排：1-3：标本（引物为CA16）4：CA16引物的阳性对照5：marker6：阴性对照7-14：标本（引物为EV71）15：EV71引物的阳性对照,RT-PCR技术,RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。,Real-TimePCR技术,在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。,TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的5末端，而淬灭剂则在3末端。,当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离，因而荧光基团发射出荧光信号。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。,一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。,为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值（thresholdvalue）。,PCR检测对标本采集及保存、运输的要求,咽拭子、粪便、疱疹液、脑脊液等。用于病毒分离和核酸检测的标本尽早采集。病毒储存液保存。冷链运输，尽快送至实验室进行检测。-20长期保存，但是流感样病例标本应于-70长期保存,新型甲型H1N1流感检测,核酸提取,使用试剂：核酸提取试剂盒QIAGENRNeasyminikit（74104）；预冷的70%乙醇溶液（无RNase水配制）（自备）；-巯基乙醇（自备）基本步骤：裂解组织，释放核酸；除去蛋白杂质；最后获得核酸产物,注意事项：1提取核酸过程中使用的所有溶液和耗材必须经过特殊处理，确保无RNase2操作过程中必须尽量保持低温，迅速3操作要在生物安全柜中进行，检测标本样品和试剂必须在生物安全柜中才可以打开操作中必须做好防护，防止降解，污染和感染；4提取好的核酸若不立即进行检测，应于-20保存,RT-PCR检测,1）反应体系配制（25ul体系）（在专门的生物安全柜中进行）：使用试剂盒：QIAGENonestepRT-PCRkit（210212）RNasefreewater11.9ul5RT-PCR缓冲液5ul10mMdNTP1ulEnzymix1ulRNasin0.1ul上游引物(20uM)0.5ul下游引物(20uM)0.5ul合计20ul,对每一个建立的反应确定反应数（n=拟进行的PCR管数，包括阴性，阳性对）。考虑到阴性无模板对照，阳性对照，误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下：（1）如果包括对照，样品的数量（n）为1到14，那么N=n+1；（2）如果包括对照，样品的数量（n）大于15，那么N=n+2。2）将上述反应液混匀，分装到0.2mLPCR小管中，每管20L，分别做好标记。3）加RNA模板（在核酸提取区）将上述分装好的PCR小管分别加入模板。首先加入阴性对照管（5L无菌水），然后分别加标本RNA（每管5L），最后加入阳性对照RNA（每管5L）。,反应条件：1、601分钟2、4210分钟3、5030分钟4、9515分钟5、9430秒6、5030秒7、721分钟回到第5步40个循环8、7210分钟9、end,电泳并观察结果：提前用1的TBE缓冲液配制1.5-2%Agrorosegel，胶块凝固后将其放置在加有1TBE缓冲液的电泳槽中，电泳缓冲液必须淹没胶块。电泳液最好新鲜配制。PCR结束后，各取5ulPCR产物和1ul6LoddingBuffer混匀，点样，同时加DL2000Marker5ul，阴、阳性对照；电泳电压：120V时间：胶块的体积和浓度都对电泳时间有影响，一般30min-1h。根据LoddingBuffer中的溴芬兰指示剂的位置来判断电泳的程度，一般蓝色指示条带泳动到胶块2/3位置处，就可以观察结果了,Real-timePCR检测,体系的配制（25ul体系）：RNasefreewater5.75ul2MasterMix12.5ulRT-Mix0.25ulPrimer-1（40uM)0.5ulPrimer-2(40uM)0.5ulProbe(10uM)0.5ul上述成分混匀，每管加入5ul待检样品的核酸，封盖，上机。样品多时，同RT-PCR体系的配制方法，混匀分装。必须同时设定阴、阳性对照和空白对照,反应条件：1、605min2、5030min3、9515min4、9515s5、5530s6、7230s7、readplate8、gotostep4，for45cycles9、725min10、readplate11、end,注意事项,RT-PCR引物稀释方法-工作浓度（20M）配制方法：110储存液配制：（1）将新合成的引物在开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。（2）用RNaseFreeWater溶解，加水量为10总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100pmol/L，即100M。2引物使用浓度配制：将100M的引物浓度再5倍稀释，配成浓度为20M，即可直接用于PCR反应。（请注意各引物管实际所标记的OD数）,Real-timePCR检测引物和探针稀释方法1引物工作浓度（40M）配制方法：（1）将新合成的引物开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。（2）用RNaseFreeWater溶解，加水量为10总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100M，可作为储存液。（例如：假设合成引物每管2OD，若1OD的量为4.75nmol（0.00475mol），则一管引物的总摩尔数为24.75=9.5nmol，加水量为109.595l）（3）将100M的引物2.5倍稀释，此时浓度为40M，可作为工作浓度。2探针工作浓度（10M）配制方法：（1）将新合成的探针管开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。（2）用RNaseFreeWater溶解，加水量为10总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100M，可作为储存液。（3）将100M的探针10倍稀释，此时浓度为10M，可作为工作浓度。,引物、探针稀释后，-20保存阳性对照RNA收到后分装成若干管，置-20或以下保存在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。使用的试剂必须从冷冻状态彻底融化混匀后使用（1）分装好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避光2-8可保存多达3个月，不要对探针反复冻融）；（2）涡旋振荡引物和探针；（3）瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。,材料及仪器,1、RNA提取试剂盒QIAGenRNeasyMiniKit（catalog#74104）2、巯基乙醇（SIGMA-MercaptoethanolLot062K0115）3、70%乙醇4、RT-PCRKit：QIAGENOnestepRT-PCRKit（catalog#210212）；QIAGENquanteticprobeRT-PCRkit（catalog#204443）5、RNasinRibonucleaseInhibitor（Promegacatalog#N2111）6、检测引物7、Axygen1.5mL离心管，货号：MCT-150-C8、Axygen0.2mLPCR管，货号：PCR-02-C9、Axygen10L，100L，200L，1000L带滤芯枪头10、10L，100L，200L，1000L加样器11、可调转速14K离心机：12、旋涡混合器：,13、生物安全柜：二级生物安全柜14、PCR仪：普通PCR仪；实时荧光PCR仪15、琼脂糖：BiowestAgaroseDistributedbyGeneTech（Shanghai）CompanyLimitedLotNo.10168516、核酸染料：E.B.;goldview17、电泳液：5TBE电泳缓冲液电泳槽、电泳仪18、1.5mleppendorf管架，0.2mlPCR管架19、6loadingbuffer20、DNAMarker(DL2000,100bp等）21、10ul无滤芯枪尖22、凝胶成像系统,1、5TBE（贮存液）Tris54g硼酸27.5g0.5MEDTA(pH8.0)20ml蒸溜水1000ml再将5TBE稀释5倍成1TBE就可以在电时使用（即工作液浓度）2、6上样缓冲液4保存0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF30%甘油水溶液,实验室分区,实验室设置上分配液区、模板提取区、扩增区、电泳区。物流应按分配液区、模板提取区、扩增区、电泳区顺序,严禁倒流。,谢谢大家！,