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PCR-单链构型多态性分析,Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP,1,什么是PCR-SSCP？,PCR-SSCP是在完成靶DNA的PCR扩增之后进行单链DNA多态性分析的一种新方法。将单链的扩增DNA或组织基因组DNA通过中性的聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据其电泳位置的改变可分辨出单个碱基的改变。,2,SSCP原理,在SSCP凝胶中电泳时，单链DNA的泳动速率主要取决于二级空间结构，因此若DNA片段中碱基发生突变，将会引起单链DNA二级空间结构的改变，使SSCP凝胶上出现异常移动的电泳带（即SSCP 阳性）。,3,4,5,PCR-SSCP 操作步骤,1. 常规PCR扩增DNA片段或其他被标DNA片段的提取。 2. 将提取的DNA在20l变性溶液（95%甲酰胺、1mmol/L EDTA, 0.05%溴酚蓝、0.05%二甲苯青），95 10分钟，冰浴3分钟。 3. 将混合液加到中性的聚丙烯酰胺凝胶板孔中，在含1xTBE的电泳液中，电泳。 4. 将凝胶中DNA片段转移到硝酸纤维薄膜上，烘干后以放射自显影拍摄记录。或银染色,6,银染原理,根据核酸分子带有多个氨基和亚氨基，一定条件下可以与银离子结合，在甲醛等还原剂的作用下，形成黑或褐色的银沉淀条带。,7,银染过程,凝胶 10%乙酸、30%乙醇固定10min 0.1%AgNO3 染色10min 2.5%碳酸钠-0.03%甲醛显色 1%乙酸终止 dH2O漂洗,dH2O漂洗两次,dH2O漂洗两次,8,影响PCR-SSCP的因素,1.DNA片段大小 2.复制错误发生 3.电泳条件 :（1）丙烯酰胺的浓度 （2）交联剂的浓度 （3）电泳的物理环境 （4）甘油浓度,9,PCR-SSCP与RFLP比较,无需特殊的限制性内切酶作用 可测出理论上任何一个碱基突变位点 操作简便，无需特殊的仪器设备及试剂 电泳条件的 改变容易影响SSCP,10,PCR-SSCP 的应用,1.基因点突变的监测 2.多态性检测 3. 外显子的筛查 4.cDNA筛查,11,
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