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一 教学要求,（1）学习抗菌活性菌株的筛选方法。 （2）掌握双层琼脂扩散法筛选抗菌活性菌株的操作方法。,实验三 双层琼脂扩散法筛选放线菌活性菌株的,1,二 实验原理,抗菌活性菌株是指那些在生长过程中能够产生抑菌或杀菌活性物质的微生物，通常利用抗生素测定的方法给予检出。抗菌抗生素的测定主要有稀释法、比浊法和扩散法。扩散法是利用药物在琼脂中扩散使其周围的指示菌生长受到抑制而形成抑菌圈，根据抑菌圈的大小来判断抗菌活性。扩散法包括了纸片法、管碟法、点滴法等多种方法。本实验采用的双层琼脂扩散法是一种抗菌活性菌株快速简便的初步筛选方，既直接在琼脂培养基上培养供测菌，产生的抗生素在琼脂中扩散，加入指示菌后测量抑菌圈直径和菌落直径比值（Di/Dc)，根据比值的大小检出活性菌株。,2,三 材料与器材,菌种：链霉菌, 枯草杆菌，大肠杆菌. 培养基：高氏1号培养基，牛肉膏蛋白胨培养基. 培养皿，移液管等.,3,四 实验步骤,（1）倒平板：在无菌培养皿中，倒入高氏一号培养基，凝固后待用。 （2）接种：用接种环挑取供测菌，在平板上涂抹成直径约0.3cm的接种点，每个平板接种46点。倒置，28培养7天。 （3）覆盖指示菌：取熔解并冷却至约55 的牛肉膏蛋白胨培养基，加入枯草杆菌或大肠杆菌的菌悬液，摇匀，终浓度约为106细胞/ml。在接种链霉菌7d后的平板上，倒入含指示菌的牛肉膏蛋白胨培养基，每皿1012ml，凝固后30 或37 培养24 h。 （4）抑菌圈大小测定：测量抑菌圈和菌落直径，根据抑菌圈和菌落直径比值（Di/Dc)检出活性菌株，比值大一般抗菌活性较强。,4,五 注意事项,（1）供测菌接种时应直径大小尽量一致 （2）指示菌加入培养液时的温度不能太高，以免杀死指示菌。温度也不能太低，以免指示菌覆盖不均,5,六 思考题,双层琼脂法在抗生素的测定中有那些优缺点？,6,
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